MicroRNA21及其靶基因PDCD4、PTEN在皮膚鱗癌發(fā)病機制中的作用研究.pdf

1、背景：
　　皮膚鱗狀細胞癌（cutaneoussquamouscellcarcinoma,CSCC）簡稱皮膚鱗癌，是最常見的皮膚惡性腫瘤之一，在非黑素細胞腫瘤性皮膚腫瘤中發(fā)病率僅次于基底細胞癌，且發(fā)病率呈逐年上升的趨勢。CSCC可發(fā)生于任何部位的皮膚或黏膜，常發(fā)生在某些原有皮膚病的癌前疾病的基礎上，或由各種癌前期疾病演變而來，少數(shù)亦可為原發(fā)性皮膚鱗癌。CSCC臨床表現(xiàn)為浸潤性斑塊、結(jié)節(jié)、潰瘍或疣狀增生，具有局部侵襲、復發(fā)和淋巴及遠

2、處轉(zhuǎn)移的特征，甚至可引起死亡。CSCC的病理表現(xiàn)為起源于鱗狀上皮細胞的腫瘤巢，伴有不同程度的細胞分化，可侵入真皮或更深的組織。高分化的細胞表現(xiàn)為大的、泡沫狀細胞核或有一個或多個細胞核和大量嗜酸性細胞質(zhì)，單個細胞的角化或腫瘤細胞癌巢內(nèi)形成角珠是CSCC的特征性標志。目前CSCC主要的治療方法有Mohs顯微描記手術(Mohsmicrographicsurgery)、化療、光動力治療、放射治療、生物治療和免疫治療等，治療方式的選擇應根據(jù)病灶的

3、大小、部位、臨床表現(xiàn)、組織病理分級、患者一般情況、患者年齡和病灶類型、原發(fā)、復發(fā)以及轉(zhuǎn)移等因素進行選擇。對病灶較小、分化良好且沒有淋巴結(jié)及遠處轉(zhuǎn)移的CSCC首選Mohs顯微描記手術治療，切除范圍至少在瘤體外方0.5～2cm，并需要足夠的深度，術中快速冰凍切片有助于腫瘤的徹底切除，較小的皮損可以直接切除縫合，較大的皮損可以應用局部帶蒂皮瓣移植術，或考慮植皮術。老年體弱、有手術禁忌癥以及頭面部結(jié)締組織不多的部位的腫瘤，特別是在腫瘤分化差、腫

4、瘤侵犯骨骼、軟骨或已有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的情況下，不適宜行手術治療，應選擇放射治療或其他治療。雖然近年來隨著診療技術的提高和治療方法的不斷改進，CSCC患者的早期診斷率和臨床治愈率大為提高，但較大皮損及轉(zhuǎn)移患者的治療仍是臨床治療的難點。因此對CSCC的發(fā)生機制、早期診斷和預防治療是當前皮膚腫瘤研究的熱點課題。
　　腫瘤是一種基因病，其發(fā)病是一個多因素、多階段、復雜漸進的過程，腫瘤發(fā)生是長期的、多步驟、多階段、多種基因突變積累的結(jié)果，腫瘤細

5、胞來自于正常細胞，但是腫瘤細胞具有超過正常的增殖能力，增生與機體不相協(xié)調(diào)，失去控制。關于微小RNAs(microRNAs，miRNAs)的研究提示miRNA在腫瘤發(fā)病中起到不可忽視的作用。miRNAs是近年來發(fā)現(xiàn)的一類長度約22個核苷酸的內(nèi)源性非編碼小分子RNA，參與細胞的生長、分化、增殖、凋亡、個體發(fā)育、機體代謝等生理過程，miRNAs的異常表達與多種腫瘤的關系密切。微小RNA21（microRNA-21，miR-21）是目前發(fā)現(xiàn)的唯

6、一一種在多個系統(tǒng)多種實體腫瘤中及血液系統(tǒng)非實體腫瘤中高表達的miRNA，也是第一個在腫瘤病人血清中檢測到的miRNA，其在腫瘤中的表達異常及其對靶基因的抑制作用在人類miRNAs功能學的研究中不可忽視。
　　miR-21通過與靶基因mRNA的3'UTR結(jié)構(gòu)相結(jié)合，抑制靶基因的表達，發(fā)揮其各種重要的功能。miR-21靶基因應具有下述3個特征:1.靶基因的表達水平與miR-21表達水平相反，miR-21高表達時靶基因低表達，反之miR

7、-21低表達時靶基因高表達;2.靶基因有miR-21的結(jié)合的互補結(jié)合位點，能夠結(jié)合miR-21，當miR-21過度表達或低表達時，熒光素酶報告實驗構(gòu)建該基因的3'UTR有相應變化;3.miR-21靶基因結(jié)合位點缺失或突變時，miR-21不能發(fā)揮抑制靶基因表達的作用。miR-21通過對靶基因的調(diào)控調(diào)節(jié)細胞的分化、增殖和凋亡，參與腫瘤細胞的侵襲、血管浸潤和轉(zhuǎn)移。在眾多的靶基因中，程序性細胞死亡因子4(programmedcelldeath4

8、，PDCD4)和第10號染色體同源丟失性磷酸酶基因和張力蛋白基因(phosphataseandtensinhomologdeletedonchromosometengene，PTEN)都是在腫瘤發(fā)生發(fā)展中具有重要功能的miR-21的靶基因。PDCD4不僅在細胞程序性死亡過程中起重要調(diào)節(jié)作用，而且通過抑制蛋白翻譯過程對腫瘤細胞的生長進行抑制。作為細胞凋亡的關鍵細胞因子，PDCD4通過多條信號通路參與、通過眾多癌基因的作用抑制腫瘤的轉(zhuǎn)化、抑

9、制腫瘤的進展和轉(zhuǎn)移。PTEN是迄今為止發(fā)現(xiàn)的第一個具有雙重特異性磷酸酶活性的抑癌基因，通過負調(diào)控磷酸肌醇-3-激酶/絲氨酸激酶信號通路在細胞的生長、增殖、遷移和細胞凋亡中具有重要的生物學功能，影響腫瘤細胞的浸潤、轉(zhuǎn)移和骨架蛋白的組裝，基因丟失、突變和/或降低表達引起的PTEN功能缺失已在多數(shù)腫瘤中發(fā)現(xiàn)。PDCD4和PTEN作為腫瘤抑制因子，可以抑制細胞的惡性轉(zhuǎn)化，阻止腫瘤發(fā)生，在多種腫瘤細胞中下調(diào)或缺失，在惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起重要作

10、用。程序性細胞死亡(programmedcelldeath,PCD)，又稱為細胞凋亡（apoptosis），在很多腫瘤細胞中細胞凋亡的程序被打破，DNA發(fā)生損傷或突變，發(fā)生細胞凋亡不足，從而導致細胞生存期延長，增殖不受限制。腫瘤是細胞凋亡異常的疾病，腫瘤細胞存在細胞增殖和分化異常，腫瘤的發(fā)生既有細胞增殖的加速的原因，細胞死亡的減緩也起到重要作用，細胞失去控制的生長，凋亡不及，細胞數(shù)失去相對恒定導致腫瘤發(fā)生。近年來的研究發(fā)現(xiàn)miR-21在

11、多種腫瘤中表達上調(diào)，腫瘤細胞凋亡出現(xiàn)異常，miR-21的靶基因PDCD4和PTEN在腫瘤中也存在表達異常。然而目前關于皮膚鱗癌發(fā)病過程中miR-21、其靶基因的作用及其對皮膚鱗癌腫瘤細胞凋亡的研究甚少。反義寡核苷酸(antisenseoligodeoxynucleotide，AS-ODN)是采用人工合成堿基序列與靶基因或mRNA某一區(qū)段互補的核酸片段，可以通過堿基互補原則結(jié)合于靶基因或mRNA，改變特定蛋白的表達。
　　為探討mi

12、R-21及其靶基因PDCD4和PTEN在皮膚鱗癌發(fā)病中的作用，本研究檢測了皮膚鱗癌組織及A431細胞株的miR-21的表達，皮膚鱗癌組織和A431細胞中miR-21的靶基因PDCD4和PTEN的蛋白表達水平及表達部位，同時采用反義寡核苷酸技術對培養(yǎng)的A431細胞進行miR-21的抑制，再檢測miR-21的靶基因PDCD4和PTEN的蛋白表達水平，并進行細胞凋亡的檢測。通過對miR-21及其靶基因在皮膚鱗癌組織及細胞株中表達的研究，試圖闡

13、明miR-21的靶基因PDCD4和PTEN在皮膚鱗癌發(fā)生、發(fā)展中的作用和意義，為皮膚鱗癌的基因治療提供試驗依據(jù)和基礎。
　　本實驗研究共分為以下兩部分。
　　第一部分miR-21及其靶基因PDCD4和PTEN蛋白在皮膚鱗癌組織中的表達
　　目的：
　　檢測miR-21及其靶基因PDCD4和PTEN在CSCC及正常皮膚組織中的表達，了解miR-21及其靶基因PDCD4和PTEN在CSCC及正常皮膚組織中表達的差異，

14、探討miR-21及其靶基因PDCD4和PTEN表達異常在CSCC發(fā)病機制中的作用及意義。
　　方法：
　　1.選擇2010年7月至2012年4月皮膚性病科經(jīng)病理確診的CSCC組織標本18例，整形外科手術切除的正常皮膚組織標本18例。
　　2.采用熒光定量RT-PCR方法檢測miR-21在18例CSCC和18例正常皮膚組織中的表達水平。
　　3.采用Westernblot和免疫組織化學方法檢測18例CSCC組織和1

15、8例正常皮膚組織中PDCD4和PTEN的表達情況。
　　4.分析miR-21的表達和CSCC的臨床分期及組織分化程度的關系。
　　結(jié)果：
　　1.CSCC組織中miR-21表達高于正常皮膚組織，兩種組織表達差異有統(tǒng)計學意義（t=10.644，P＜0.001）。MiR-21表達與CSCC的發(fā)病年齡、性別的差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），而與腫瘤分期及病理分級的差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。
　　2.West

16、ernblot方法檢測CSCC組織中PDCD4的灰度相對定量值為0.692±0.072，比正常皮膚組織中PDCD4的灰度相對定量值1.018±0.045低（t=-11.522，P＜0.05）。免疫組織化學方法檢測正常皮膚組織中PDCD4蛋白呈高表達，陽性染色定位于細胞漿和細胞核;CSCC組織中PDCD4蛋白呈低表達或不表達，陽性染色主要定位于細胞漿。CSCC組織PDCD4蛋白表達低于正常皮膚組織，兩種組織表達差異具有統(tǒng)計學意義(Z=-3

17、.573，P＜0.001)。
　　3.Westernblot方法檢測CSCC組織中PTEN的灰度相對定量值為0.493±0.141，比正常皮膚組織中PTEN的灰度相對定量值0.977±0.029低(t=-10.047，P＜0.05)。免疫組織化學方法檢測正常皮膚組織中PTEN蛋白呈高表達，陽性染色定位于細胞漿和細胞核;CSCC組織PTEN蛋白呈低表達或不表達，陽性染色主要定位于細胞漿。CSCC組織PTEN蛋白表達低于正常皮膚組織，

18、兩種組織表達差異具有統(tǒng)計學意義(Z=-3.237，P＜0.05)。
　　小結(jié)：
　　1.miR-21在CSCC組織中呈高表達，其表達水平與腫瘤分期及病理分級的差異有關。
　　2.miR-21的靶基因PDCD4及PTEN蛋白在CSCC組織中呈低表達或不表達，陽性染色主要定位于細胞漿。
　　第二部分反義抑制miR-21對其靶基因PDCD4和PTEN蛋白表達及細胞凋亡在皮膚鱗癌A431細胞株中的影響
　　目的：<

19、br>　　探討反義抑制miR-21對其靶基因PDCD4和PTEN在CSCCA431細胞株中表達的影響及對細胞凋亡的影響，探討miR-21對CSCC發(fā)病機制的作用及反義抑制miR-21在CSCC治療中的意義。
　　方法：
　　1.A431細胞分為Cell組:未轉(zhuǎn)染的A431細胞;NC組:轉(zhuǎn)染無關序列的A431細胞;AS-ODN組:轉(zhuǎn)染miR-21AS-ODNA431細胞。
　　2.采用熒光定量RT-PCR檢測miR-21

20、在各組細胞中的表達水平。
　　3.采用Westernblot和免疫細胞化學方法檢測各組細胞中PDCD4和PTEN的表達情況。
　　4.采用TUNEL檢測轉(zhuǎn)染前后A431細胞株中細胞凋亡情況。
　　結(jié)果：
　　1.轉(zhuǎn)染miR-21抑制物后皮膚鱗癌細胞株A431中miR-21表達下降，Cell組為1.00±0.06、NC組為0.98±0.77、AS-ODN組為0.42±0.01，三組表達有差異(F=107.24，P＜

21、0.05)，Cell組和NC組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），Cell組和AS-ODN組、NC組和AS-ODN組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。
　　2.轉(zhuǎn)染miR-21抑制物后A431細胞株中PDCD4和PTEN的表達增強。Westernblot檢測三組細胞中PDCD4表達的灰度相對定量值Cell組為1.021±0.035、NC組為0.979±0.061，AS-ODN組為1.827±0.023，差異有統(tǒng)計學意義(F=

22、119.13，P＜0.05)，轉(zhuǎn)染miR-21抑制物后A431細胞中PDCD4表達增加。三組細胞中PTEN表達表達的灰度相對定量值Cell組為1.014±0.052、NC組為0.985±0.027，AS-ODN組為2.554±0.034，差異有統(tǒng)計學意義(F=249.64，P＜0.05)，轉(zhuǎn)染miR-21抑制物后A431細胞中PTEN表達增加。
　　3.免疫細胞化學方法檢測PDCD4在細胞核以及細胞漿均有表達，cell組以及NC組

23、染棕褐色，均少量表達，AS-ODN組染棕褐色，強表達。PTEN在細胞核以及細胞漿均有表達，cell組以及NC組染棕黃色，均少量表達，AS-ODN組染棕褐色，強表達。
　　4.轉(zhuǎn)染miR-21抑制物后A431細胞株中PDCD4和PTEN的表達增強。免疫細胞化學法PDCD4表達Cell組為62340.03±2157.52、NC組為55871.36±7281.27，AS-ODN組為175302.34±14571.90，三組表達差異有統(tǒng)計

24、學意義(F=50.12，P＜0.05)，Cell組和NC組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），Cell組和AS-ODN組、NC組和AS-ODN組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。PTEN表達Cell組為19206.26±655.01、NC組為19149.26±1058.29，AS-ODN組為135572.92±4685.05，三組表達差異有統(tǒng)計學意義(F=576.54，P＜0.05)，Cell組和NC組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0

25、.05），Cell組和AS-ODN組、NC組和AS-ODN組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。
　　5.轉(zhuǎn)染miR-21抑制物后A431細胞株中細胞凋亡率較Cell組和NC組增加（圖3），細胞凋亡率Cell組為0.10±0.02、NC組為0.13±0.01，AS-ODN組為0.36±0.03，三組表達差異有統(tǒng)計學意義(F=201.79，P＜0.05)，Cell組和NC組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），Cell組和AS-O

26、DN組、NC組和AS-ODN組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　小結(jié)：
　　1.轉(zhuǎn)染Anti-miR-21后A431細胞株中miR-21表達下降，表明miR-21AS-ODN可成功抑制A431細胞株中miR-21的表達。
　　2.反義抑制miR-21后A431細胞株中PDCD4的表達比反義抑制前增高，反義抑制miR-21后A431細胞株中PTEN的表達比反義抑制前增高。
　　3.反義抑制miR-21后A

27、431細胞株中凋亡細胞比例比反義抑制前增高。
　　結(jié)論：
　　1.miR-21在CSCC組織中呈高表達，其表達和腫瘤的臨床分期及分化程度相關。
　　2.miR-21靶基因PDCD4P和TEN蛋白在CSCC組織中呈低表達，陽性染色主要定位于細胞漿。
　　3.轉(zhuǎn)染Anti-miR-21后A431細胞株中miR-21表達下降，成功構(gòu)建抑制miR-21的A431細胞株。
　　4.反義抑制miR-21可以上調(diào)A431