Pdcd4對(duì)脂肪來源干細(xì)胞的調(diào)控及其在飲食誘導(dǎo)肥胖中的作用.pdf

1、本文分為兩個(gè)部分進(jìn)行探討：
　　第一部分 Pdcd4對(duì)脂肪來源干細(xì)胞的調(diào)控及其在飲食誘導(dǎo)肥胖中的作用
　　目的：
　　分別將來自WT和Pdcd4-/-小鼠的ADSC進(jìn)行體外培養(yǎng)，檢測(cè)兩種來源的ADSC在干性標(biāo)志、增殖能力和成脂分化等方面的不同，并進(jìn)一步探討其內(nèi)在機(jī)制;同時(shí)利用動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)對(duì)相關(guān)結(jié)論進(jìn)行了驗(yàn)證。
　　方法：
　　一、 Pdcd4缺失對(duì)ADSC干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志的影響
　　1.ADSC的提取和

2、培養(yǎng)
　　分離WT和Pdcd4-/-小鼠附睪處脂肪組織，剪碎后加入相應(yīng)體積的膠原酶，37℃搖床45 min后觀察消化情況并終止消化，過濾離心即得到含有ADSC的基質(zhì)血管成分（Stromal vascular fraction，SVF）。用培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，接種至6孔板中進(jìn)行培養(yǎng)擴(kuò)增。每2-3天換液一次，待細(xì)胞融合度達(dá)到90％左右時(shí)進(jìn)行傳代。
　　2.ADSC表面干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志檢測(cè)
　　通過流式細(xì)胞術(shù)的方法，分別檢測(cè)WT和

3、Pdcd4-/-ADSC表面陽性標(biāo)志CD105、CD90和陰性標(biāo)志CD11b、CD11c的表達(dá)情況。
　　3.Pdcd4缺失對(duì)ADSC干性標(biāo)志的影響
　　分別提取WT和Pdcd4-/-ADSC和SVF中總RNA，檢測(cè)RNA濃度并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，通過Real-time PCR的方法來檢測(cè)干性標(biāo)志Nanog、 Oct4和Sox2的表達(dá)。
　　二、Pdcd4缺失對(duì)ADSC自我更新能力的影響
　　1.Pdcd4缺失對(duì)ADSC

4、增殖能力的影響
　　體外實(shí)驗(yàn):首先通過CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)WT和Pdcd4-/-ADSC在培養(yǎng)12 h和24 h后細(xì)胞增殖能力的不同，通過克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其克隆形成能力的差異。接下來又通過EdU摻入和PI染色檢測(cè)細(xì)胞的增殖及周期變化。
　　體內(nèi)實(shí)驗(yàn):將EdU通過腹腔注射到WT和Pdcd4-/-小鼠體內(nèi)，24h后取附睪處脂肪組織，固定包埋切片并進(jìn)行染色，觀察脂肪組織中ADSC的增殖情況。
　　2.Pdcd4缺失對(duì)ADSC增

5、殖相關(guān)信號(hào)通路的影響
　　取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的WT和Pdcd4-/-ADSC，用Western-blot的方法檢測(cè)p-AKT和細(xì)胞周期蛋白cyclinD1的表達(dá)情況。為了進(jìn)一步驗(yàn)證AKT通路在ADSC增殖過程中的影響，我們?cè)诩?xì)胞培養(yǎng)過程中加入2μM AKT抑制劑MK2206，用Western-blot和EdU摻入的方法檢測(cè)加入抑制劑之后細(xì)胞增殖的變化。
　　結(jié)果：
　　一、Pdcd4缺失增強(qiáng)ADSC干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志的表達(dá)<

6、br>　　1.Pdcd4缺失增強(qiáng)ADSC表面標(biāo)志的表達(dá)
　　檢測(cè)WT和Pdcd4-/-ADSC在體外培養(yǎng)擴(kuò)增后干細(xì)胞相關(guān)表型的表達(dá)。對(duì)兩種不同來源的ADSC進(jìn)行拍照觀察，兩種細(xì)胞在形態(tài)上并沒有明顯的差異。WT和Pdcd4-/-ADSC都高表達(dá)干細(xì)胞相關(guān)的表面標(biāo)志CD105和CD90，不表達(dá)或者低表達(dá)CD11b和CD11c。不同的是，與WT ADSC相比，Pdcd4-/-ADSC表面CD105和CD90的表達(dá)水平明顯增高。
　

7、　2.Pdcd4缺失增強(qiáng)ADSC干性相關(guān)標(biāo)志的表達(dá)
　　接下來，我們檢測(cè)了干細(xì)胞干性相關(guān)基因Nanog、 Oct4和Sox2在mRNA水平的變化。與WTADSC相比，Pdcd4-/-ADSC中Nanog、 Oct4在mRNA水平的表達(dá)明顯上調(diào)，而Sox2變化不是很明顯。為了排除體外擴(kuò)增培養(yǎng)對(duì)ADSC的可能影響，我們又檢測(cè)了ND小鼠SVF中干性相關(guān)基因的表達(dá)。結(jié)果顯示，Pdcd4-/-小鼠SVF中Nanog、 Oct4和Sox2的表

8、達(dá)在mRNA水平的表達(dá)都較WT小鼠SVF中顯著增高。
　　二、Pdcd4缺失增強(qiáng)ADSC的自我更新能力
　　1.Pdcd4缺失促進(jìn)ADSC由G1期進(jìn)入到S期，進(jìn)而促進(jìn)ADSC的增殖
　　從CCK-8方法繪制的生長(zhǎng)曲線和克隆形成實(shí)驗(yàn)的結(jié)果都可以看出Pdcd4缺失能夠促進(jìn)ADSC的增殖。而EdU染色的結(jié)果提示Pdcd4-/-ADSC有較多的細(xì)胞處于細(xì)胞周期的S期，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期的結(jié)果顯示與WTADSC相比，Pdcd

9、4-/-ADSC處于S期的細(xì)胞比例增大，而處于G1期的細(xì)胞數(shù)明顯減少。WAT石蠟切片的EdU染色結(jié)果顯示，Pdcd4-/-WAT中有較多的細(xì)胞處于增殖期。提示Pdcd4缺失可以增強(qiáng)小鼠WAT中ADSC的干性。以上結(jié)果表明Pdcd4缺失能夠促進(jìn)ADSC由G1期進(jìn)入到S期，進(jìn)而促進(jìn)ADSC的增殖。
　　2.Pdcd4缺失引起的ADSC周期變化依賴于AKT信號(hào)通路的激活
　　利用Western-blot的方法檢測(cè)WT和Pdcd4-

10、/-ADSC中AKT的活化狀態(tài)，結(jié)果顯示與WT ADSC相比，Pdcd4-/-ADSC中p-AKT的水平明顯上調(diào)，cyclinD1表達(dá)也顯著增強(qiáng)。加入AKT抑制劑MK2206后，WT ADSC的細(xì)胞增殖受到了明顯的抑制，EdU陽性的細(xì)胞數(shù)也明顯降低，但cyclinD1的變化不大。然而在Pdcd4-/-ADSC中，AKT的抑制伴隨著cyclinD1表達(dá)的顯著下調(diào)，EdU陽性的細(xì)胞數(shù)也大大降低。以上結(jié)果表明Pdcd4缺失引起的ADSC由G1

11、期向S期的轉(zhuǎn)換依賴于AKT信號(hào)通路的激活。
　　結(jié)論：
　　1.Pdcd4缺失增強(qiáng)ADSC的干性。
　　2.Pdcd4缺失通過激活A(yù)KT通路促進(jìn)ADSC的G1/S期轉(zhuǎn)換，進(jìn)而促進(jìn)其增殖。
　　3.Pdcd4缺失促進(jìn)ADSC由白色脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為米色脂肪細(xì)胞。
　　第二部分 Pdcd4在氧化低密度脂蛋白和高脂飲食誘導(dǎo)應(yīng)激顆粒形成中的作用研究
　　目的：
　　檢測(cè)了高脂飲食條件下Pdcd4對(duì)巨噬細(xì)胞

12、和肝組織中SG形成的影響，并進(jìn)一步用ox-LDL刺激巨噬細(xì)胞、HeLa細(xì)胞和HepG2細(xì)胞，觀察在體外誘導(dǎo)條件下Pdcd4對(duì)SG形成的影響，并探討其內(nèi)在機(jī)制。
　　方法：
　　1.高脂小鼠巨噬細(xì)胞和肝組織中SG的檢測(cè)
　　首先用野生型(Wild type，WT)和Pdcd4-/-雄性小鼠建立飲食誘導(dǎo)肥胖模型，取高脂飲食WT和Pdcd4-/-小鼠腹腔巨噬細(xì)胞和肝組織的石蠟切片進(jìn)行TIA-1的免疫熒光染色，觀察TIA-1+

13、SG的形成。
　　2.Pdcd4在SG形成中的作用
　　分別提取WT和Pdcd4-/-小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，設(shè)置ox-LDL刺激組和對(duì)照組，進(jìn)行TIA-1的免疫熒光染色，觀察SG的形成情況，并對(duì)含有SG的細(xì)胞數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　3.Pdcd4與SG的定位關(guān)系
　　Ox-LDL分別刺激WT巨噬細(xì)胞和轉(zhuǎn)染了pEGFP-C1-Pdcd4質(zhì)粒的HeLa細(xì)胞，24 h后進(jìn)行SG特異性標(biāo)志TIA-1、FXR1和eIF4A的免

14、疫熒光染色，觀察Pdcd4與SG標(biāo)志的定位關(guān)系。
　　結(jié)果：
　　1.高脂喂養(yǎng)Pdcd4-/-小鼠中巨噬細(xì)胞和肝組織中的SG減少
　　首先，我們以TIA-1作為應(yīng)激顆粒的標(biāo)志，檢測(cè)WT和Pdcd4-/-小鼠腹腔巨噬細(xì)胞和肝組織中SG的形成。結(jié)果顯示，WT巨噬細(xì)胞中可以明顯得觀察到TIA-1+ SG，而Pdcd4-/-巨噬細(xì)胞中則很少，肝組織中也出現(xiàn)類似的現(xiàn)象。這些數(shù)據(jù)表明，SG能夠參與高脂飲食誘導(dǎo)的應(yīng)激反應(yīng)，更重要的是

15、揭示在高脂飲食的刺激下，Pdcd4是SG形成的一個(gè)關(guān)鍵因素。
　　2.Pdcd4缺失能夠降低ox-LDL刺激的巨噬細(xì)胞中TIA-1+ SG的形成
　　我們用ox-LDL刺激分別刺激WT和Pdcd4-/-巨噬細(xì)胞，結(jié)果顯示W(wǎng)T巨噬細(xì)胞中含TIA-1+SG的細(xì)胞數(shù)顯著升高，而Pdcd4-/-巨噬細(xì)胞中含TIA-1+SG的細(xì)胞數(shù)變化并不明顯，只有很少的細(xì)胞中可觀察到SG。與WT巨噬細(xì)胞相比，Pdcd4-/-巨噬細(xì)胞中含有TIA-1

16、+SG的細(xì)胞數(shù)明顯下降。以上結(jié)果說明，Pdcd4缺失能夠降低ox-LDL刺激的巨噬細(xì)胞中TIA-1+SG形成。
　　3.Ox-LDL刺激的巨噬細(xì)胞中Pdcd4與SG特異性標(biāo)志的共定位
　　免疫熒光的結(jié)果顯示，在ox-LDL刺激的WT巨噬細(xì)胞中Pdcd4與SG特異性標(biāo)志TIA-1、FXR1和eIF4A的表達(dá)具有良好的共定位關(guān)系，說明ox-LDL可以誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞中SG的產(chǎn)生，Pdcd4可能是SG的一個(gè)重要組成部分。
　　結(jié)