脂肪間充質(zhì)干細胞外泌體對巨噬細胞極化的調(diào)節(jié)及其在飲食誘導肥胖中的作用.pdf

1、研究背景和目的
　　肥胖是由于能量攝入大于消耗導致脂肪在體內(nèi)過度堆積而形成的一種慢性代謝性疾病。眾所周知，肥胖可以誘發(fā)胰島素抵抗、高血糖、高血壓、高血脂等一系列代謝綜合征，并進一步導致Ⅱ型糖尿病、動脈粥樣硬化等心血管疾病甚至癌癥的發(fā)生。近年來，由于飲食結構以及生活方式的改變，肥胖在全世界的發(fā)病率逐年升高，已經(jīng)發(fā)展為嚴重影響人類健康的疾病。因此針對肥胖的干預治療是預防和治療肥胖相關疾病的重要措施。
　　巨噬細胞是脂肪組織中的重

2、要免疫細胞。目前認為巨噬細胞可分為兩種亞型，一種是經(jīng)典活化的M1型巨噬細胞，介導炎癥反應;另一種是選擇性活化的M2型巨噬細胞，具有抑制炎癥的作用。有研究證實，正常的腹內(nèi)白色脂肪組織中以M2巨噬細胞為主，參與維持脂肪組織的免疫穩(wěn)態(tài);而隨著肥胖的發(fā)生，白色脂肪組織中浸潤的巨噬細胞則以M1巨噬細胞為主，介導脂肪組織炎癥的發(fā)生發(fā)展。由于脂肪組織炎癥是胰島素抵抗和代謝綜合征發(fā)生的關鍵因素，因此調(diào)控巨噬細胞的活化是抑制脂肪組織炎癥、控制肥胖相關代謝

3、紊亂的重要措施。
　　脂肪來源間充質(zhì)干細胞(adipose-derived stem cell，ADSC)，是存在于脂肪組織中的間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells，MSC)，具有多向分化潛能，是目前組織修復和再生領域的研究重點和熱點。我們的前期工作中證實，ADSC可促進巨噬細胞向M2方向極化，進而抑制肥胖誘發(fā)的脂肪組織炎癥，增強肥胖小鼠對胰島素的敏感性。但ADSC影響巨噬細胞向M2型極化的機制尚不清楚。

4、r>　　外泌體(exosome)是由細胞分泌的直徑約在30-150nm大小的囊泡樣結構小體，內(nèi)含有多種具有生物學活性的蛋白質(zhì)和RNA，參與細胞之間信息的交流與傳遞。因來源的細胞不同，外泌體的成分和功能也有所不同。有研究證實，外泌體不但可以作為腫瘤等疾病的生物學診斷標志物，在疾病的治療中也起到重要作用。MSC因在維持機體穩(wěn)態(tài)中起重要作用，故針對MSC來源外泌體的研究也得到了大家的廣泛關注。但針對ADSC來源外泌體的研究少有涉及，而ADSC

5、來源外泌體對巨噬細胞極化的調(diào)節(jié)以及在飲食誘導肥胖中的作用尚無研究。
　　為了明確ADSC來源外泌體在調(diào)節(jié)巨噬細胞以及飲食誘導肥胖中的作用，我們進行了以下實驗研究，通過高脂飲食喂養(yǎng)建立小鼠肥胖模型，并用ADSC來源外泌體對肥胖模型小鼠進行干預，證實了ADSC來源外泌體可以抑制高脂飲食小鼠的脂肪組織炎癥和代謝紊亂，并減緩其肥胖的進展;此外，我們的研究亦證實ADSC來源外泌體可以促進巨噬細胞向M2方向極化，進而抑制肥胖相關脂肪組織炎癥并

6、延緩肥胖的進展。這為肥胖的干預治療提供了新的思路與方向。
　　方法：
　　一、ADSC的分離擴增和培養(yǎng)
　　取10-12周齡的C57BL/6雄性小鼠的附睪處脂肪組織，將組織剪碎后加入Ⅰ型膠原酶，37℃搖床中消化45分鐘。過濾離心后，把得到的血管基質(zhì)成分（stromal vascular fraction，SVF）接種到六孔板中進行培養(yǎng)擴增，24小時后換液以去除懸浮細胞。當細胞達到80％融合度時，可進行細胞傳代。傳代后梭

7、形的貼壁細胞即為ADSC。取第四代細胞進行后續(xù)實驗。
　　二、小鼠腹腔巨噬細胞的獲取
　　取6-8周齡的C57BL/6雄性小鼠，腹腔注射1ml6％無菌淀粉溶液，72小時后麻醉后處死小鼠，用無血清的DMEM培養(yǎng)基灌洗腹腔，收集腹腔灌洗液，過濾離心后，用含有10％血清的培養(yǎng)基重懸巨噬細胞，計數(shù)，接種于12孔板或者6孔板中，過夜培養(yǎng)后可用于后續(xù)實驗。
　　三、ADSC來源外泌體的提取與鑒定
　　用去除外泌體的培養(yǎng)基培養(yǎng)

8、ADSC，取第四代ADSC的培養(yǎng)上清，過濾離心后，取上室濃縮液于新的無菌的15ml離心管中，加入Exoquick-TCTM外泌體提取試劑提取外泌體，無菌PBS重懸沉淀并分裝，-80℃冷凍保存。
　　將提取的外泌體分別用納米粒度分析儀、透射電鏡的方法對其大小以及形態(tài)進行檢測，用Western-blot的方法檢測外泌體標志TSG101、CD9、CD63、HSP90的表達。
　　四、體外研究ADSC來源外泌體對巨噬細胞的影響

9、>　　ADSC來源外泌體與小鼠腹腔巨噬細胞共孵育，用熒光定量PCR的方法檢測巨噬細胞M1相關表型誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白介素12（interleukin-12，IL-12），以及M2相關表型精氨酸酶1（arginase-1，Arg-1）、白介素10(interleukin-10，IL-

10、10)的mRNA表達水平。Western-blot檢測Arg-1的表達變化。
　　用LPS和IFN-γ聯(lián)合刺激經(jīng)外泌體孵育過的巨噬細胞，用熒光定量PCR的方法檢測巨噬細胞中iNOS、TNF-α、IL-12的mRNA表達水平。用ELISA的方法檢測巨噬細胞中炎性因子TNF-α、IL-12的蛋白表達水平。
　　五、小鼠肥胖模型的建立及ADSC來源外泌體干預治療
　　C57BL/6雄性小鼠在8周齡時給予60％高脂飼料喂養(yǎng)20

11、-26周，以建立飲食誘導肥胖模型，對照組小鼠采用常規(guī)飼料喂養(yǎng)。在高脂飲食喂養(yǎng)末期，對小鼠進行為期6-8周的外泌體干預治療（腹腔注射，30μg/小鼠，每3天注射一次）。
　　六、ADSC來源外泌體干預對小鼠肥胖的影響
　　在高脂飲食喂養(yǎng)期間，每周對各組實驗小鼠進行稱重，并于外泌體干預期間監(jiān)測小鼠攝食量的變化。外泌體干預結束后，稱量各組小鼠的體重，觀察外泌體干預治療對肥胖小鼠體重的影響。麻醉后處死小鼠，取其附睪處白色脂肪組織、皮

12、下白色脂肪組織以及棕色脂肪組織進行稱重，計算各部位脂肪組織重量占體重的百分比，并進行統(tǒng)計分析。
　　七、ADSC來源外泌體干預對小鼠代謝參數(shù)的影響
　　ADSC來源外泌體治療過程中或治療后，分別對實驗小鼠進行葡萄糖耐量實驗(glucose tolerance test，GTT)、胰島素耐量實驗(insulin glucose tolerance test，ITT)檢測，以及檢測血清中甘油三酯(triglyceride，TG)

13、和總膽固醇(totalcholesterol，TC)的變化。
　　八、ADSC來源外泌體干預對小鼠白色脂肪組織米色化的影響
　　外泌體干預結束后，取小鼠附睪處以及皮下脂肪組織，Trizol法抽提RNA后，用熒光定量PCR的方法檢測棕色脂肪UCP1、PGC1α，米色脂肪標志TBX1、TMEM26的mRNA水平的表達。Western-blot的方法檢測UCP1在蛋白水平的表達。
　　九、ADSC來源外泌體干預對脂肪組織炎癥

14、及巨噬細胞活化的影響
　　取小鼠附睪處白色脂肪組織，ELISA檢測附睪處脂肪組織塊培養(yǎng)上清中TNF-α、IL-10的表達;熒光定量PCR檢測小鼠附睪處白色脂肪組織SVF中TNF-α、IL-6、IL-12等的表達;流式細胞術檢測小鼠附睪處白色脂肪組織SVF中F4/80、Arg-1的表達。
　　結果：
　　一、ADSC來源外泌體促進巨噬細胞向M2型極化
　　將ADSC來源外泌體作用于小鼠腹腔巨噬細胞，熒光定量PCR結

15、果顯示，外泌體刺激顯著上調(diào)巨噬細胞M2相關表型Arg-1、IL-10的mRNA表達水平，而其M1相關表型iNOS、TNF-α、IL-12的mRNA表達水平則無明顯變化。Western-blot結果顯示，外泌體孵育后巨噬細胞中Arg-1的蛋白表達水平明顯升高。此外，將經(jīng)外泌體孵育的巨噬細胞用LPS和IFN-γ進行聯(lián)合刺激，發(fā)現(xiàn)外泌體孵育的巨噬細胞對LPS和IFN-γ刺激的反應性明顯降低，其iNOS、TNF-α和IL-12的表達水平較未經(jīng)外

16、泌體孵育的巨噬細胞有顯著下調(diào)。以上結果提示ADSC來源外泌體可促進巨噬細胞的M2極化，進而抵抗LPS和IFN-γ誘導的巨噬細胞炎癥反應。
　　二、ADSC來源外泌體抑制肥胖小鼠的體重增加
　　將高脂喂養(yǎng)的肥胖模型小鼠分為外泌體干預組(HFD-exosome)和生理鹽水組(HFD-NS)，以常規(guī)飲食喂養(yǎng)的小鼠注射生理鹽水作為對照組(NCD-NS)。外泌體干預結束后，對小鼠體重及其小鼠附睪處白色脂肪組織、皮下白色脂肪組織、棕色脂

17、肪組織稱重發(fā)現(xiàn)，高脂喂養(yǎng)導致小鼠體重及白色脂肪組織重量明顯增加，而外泌體干預治療后，小鼠的體重以及各個部位的白色脂肪組織重量較HFD-NS組均明顯下降。
　　三、ADSC來源外泌體改善高脂喂養(yǎng)小鼠的代謝紊亂
　　GTT和ITT結果顯示，相對于HFD-NS組的小鼠，HFD-exosome組小鼠對葡萄糖的耐受性和對胰島素的敏感性都有明顯的改善，且在多個時間點上均具有統(tǒng)計學差異。試劑盒檢測血清中甘油三酯和膽固醇的水平發(fā)現(xiàn)，高脂飲食

18、喂養(yǎng)后，肥胖小鼠血清中甘油三酯和膽固醇的水平明顯上調(diào)，而外泌體干預治療后血清甘油三酯和膽固醇的水平則明顯下調(diào)。
　　四、ADSC來源外泌體促進高脂喂養(yǎng)小鼠的白色脂肪米色化
　　外泌體干預結束后，取小鼠附睪處以及皮下白色脂肪組織進行熒光定量PCR。結果顯示，HFD-exosome組中附睪處和皮下白色脂肪組織中棕色及米色脂肪細胞標志基因UCP1、PGC1α、TBX1、TMEM26的表達量較HFD-NS組均有不同程度的升高。Wes

19、tern-blot結果顯示，與HFD-NS組相比，HFD-exosome組小鼠的附睪處以及皮下白色脂肪組織中UCP1的蛋白水平明顯升高。由此可以看出，ADSC來源外泌體可以促進高脂喂養(yǎng)小鼠的白色脂肪米色化。
　　五、ADSC來源外泌體促進白色脂肪組織中巨噬細胞的M2極化并抑制白色脂肪組織炎癥
　　附睪處白色脂肪組織的體外培養(yǎng)結果顯示，外泌體干預治療后，小鼠附睪處白色脂肪組織分泌的促炎細胞因子TNF-α較HFD-NS組明顯降低

20、，而抑炎細胞因子IL-10的表達水平則明顯升高。同時，熒光定量PCR檢測結果顯示，高脂喂養(yǎng)的肥胖小鼠附睪處白色脂肪組織SVF中TNF-α、IL-12和IL-6的mRNA水平較NCD-NS組均有不同程度的升高，而外泌體干預則可顯著降低以上炎性細胞因子的表達。相反，外泌體干預治療可明顯上調(diào)高脂喂養(yǎng)小鼠SVF中M2相關Arg-1的mRNA水平。流式結果亦顯示，外泌體干預治療可明顯上調(diào)高脂喂養(yǎng)小鼠白色脂肪組織中巨噬細胞的Arg-1表達水平。以上