骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體的免疫調(diào)節(jié)功能研究.pdf

1、再生障礙性貧血（aplastic anemia，AA）是一種骨髓造血功能衰竭性疾病，以骨髓造血功能低下和全血細(xì)胞減少為特征，表現(xiàn)為貧血、出血、感染[1]。其中重型AA和極重型AA一旦確診后，應(yīng)立刻進(jìn)行治療，否則大部分患者會(huì)在確診后的1至2年內(nèi)死于嚴(yán)重的感染或出血等并發(fā)癥[2]。目前，一線治療主要是造血干細(xì)胞移植和免疫抑制劑治療兩種方式[3]。然而，免疫抑制劑治療后，仍有超過30％的患者療效欠佳。同時(shí)，由于尋找同胞供者極其困難，在兄弟姐妹

2、中找到同胞全相合的供者的機(jī)會(huì)低于25％，雖然單倍體移植療效不斷提高，但仍有較高的移植物抗宿主病(GVHD)及造血恢復(fù)不良[4]。這使得研究新的有效的AA治療手段極為重要。
　　近年來，越來越多的關(guān)于間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)的基礎(chǔ)和臨床實(shí)驗(yàn)在全世界多學(xué)科各專業(yè)中進(jìn)行，這點(diǎn)燃了對(duì)多種難治性疾病的治療新希望[5-7]。MSCs是一群能自我更新并具有多系分化潛能的基質(zhì)干細(xì)胞，能夠分化為多種組織

3、和器官的功能細(xì)胞，如骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、心肌細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞等[8]。不斷有證據(jù)證明MSCs具有潛在的免疫調(diào)節(jié)功能、抗炎癥的能力、營養(yǎng)和修復(fù)作用[9，10]。尤其是其免疫調(diào)節(jié)能力，使MSCs已在臨床上廣泛用于治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)，移植排斥反應(yīng)(GVHD)等免疫性疾病[7，11，12]。此外也有報(bào)道將MSCs應(yīng)用于AA等血液系統(tǒng)疾病的治療，取得了很好的療效。研究表明，MSCs的作用主要依賴其分化作用和旁分泌作用發(fā)揮其療效。而在這兩種方

4、式中，越來越多研究結(jié)果傾向于MSCs對(duì)器官的修復(fù)作用或者其免疫調(diào)節(jié)功能主要是通過其旁分泌作用，而不是分化作用。但是關(guān)于MSCs如何通過旁分泌的方式發(fā)揮作用目前仍不明確。
　　外泌體(exosome)是細(xì)胞分泌的，直徑約40-100nm的囊泡。在生理或病理情況下，由多種細(xì)胞內(nèi)膜以出芽方式形成的多泡體，參與細(xì)胞間的信息交流，并參與到多種生理病理過程中[13]。既往很多研究已證明外泌體的細(xì)胞間通訊發(fā)揮了重要的作用。研究證明，MSCs分泌

5、的外泌體在減少心肌損傷、保護(hù)急性腎小管損傷、促進(jìn)神經(jīng)組織再生、減少肺損傷等方面有重要作用，MSCs可能通過外泌體發(fā)揮其損傷修復(fù)和免疫調(diào)控功能[14-16]。
　　近年來，MSCs的臨床應(yīng)用受到了越來越廣泛的關(guān)注。但是MSCs成分較為復(fù)雜使得其安全性受到爭議。同時(shí)，MSCs由于其多被滯留在肺組織、肝組織等血管網(wǎng)發(fā)處，極少能到達(dá)靶組織發(fā)揮作用，大大局限了MSCs的治療效果[17]。然而，外泌體成分相對(duì)單一，結(jié)構(gòu)特征使其能更高效率到達(dá)靶

6、組織，較MSCs應(yīng)用更為安全、效率更高。因而，對(duì)外泌體的生物特性與功能機(jī)制的深入研究，對(duì)認(rèn)識(shí)并解決MSC應(yīng)用中產(chǎn)生的問題有重要作用，能夠?yàn)榕R床上從成分復(fù)雜的MSCs細(xì)胞治療過渡到相對(duì)單一成分的exosome治療奠定基礎(chǔ)。
　　目的:通過研究MSCs來源的exsome在免疫調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮的作用及其機(jī)制，探索exosome應(yīng)用于臨床治療AA等免疫性疾病的可能性。
　　方法:(1)在取得健康志愿者本人的同意后，簽訂知情同意書，從捐

7、獻(xiàn)者髂骨取出骨髓液10ml。應(yīng)用全骨髓貼壁培養(yǎng)法分離出人骨髓MSCs。(2)在取得AA患者和健康志愿者同意簽訂知情同意書后，取外周血10ml，應(yīng)用密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)。
　　(3)將第3代MSCs培養(yǎng)并進(jìn)行成脂、成骨誘導(dǎo)分化鑒定。(4)檢測(cè)AA患者免疫系統(tǒng)的異常，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法(ELISA)檢測(cè)其炎癥因子IFN-γ，TNF-α的分

8、泌水平，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)其T細(xì)胞亞群分布。(5)收集MSCs P4-P6代上清提取exosome，透射電鏡觀察其形態(tài)，NANOSIGHT檢測(cè)其大小分布范圍;蛋白印跡法檢測(cè)其表面特異標(biāo)志CD63;bicinchoninic acid(BCA)方法定量檢測(cè)外泌體蛋白分泌量;(6) exosome與健康志愿者PBMCs作用72小時(shí)后，用ELISA檢測(cè)上清中IL-1β，TNF-α和TGF-β分泌水平;AnnexinⅤ檢測(cè)PBMCs和CD3+T細(xì)胞

9、的凋亡率;CFSE檢測(cè)PBMCs和CD3+T細(xì)胞的增殖;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)T細(xì)胞亞群，Treg，Th1，Th2，Th17的比例變化;(6) Ehrlich試劑盒檢測(cè)exosomes與PBMCs共培養(yǎng)72小時(shí)的培養(yǎng)上清中吲哚胺2，3二氧化酶(IDO)的表達(dá)量。
　　統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:應(yīng)用SPSS19.0軟件統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料均以（(x)±s）表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析，多組間比較采用單因素方差分析，當(dāng)方差不齊時(shí)采用近似F檢驗(yàn)W

10、elch法;多重比較時(shí)方差齊采用Turkey法，方差不齊采用Dunnett'T3法。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，雙側(cè)檢驗(yàn)。
　　結(jié)果:(1)經(jīng)全骨髓貼壁培養(yǎng)法分離的人骨髓MSCs，培養(yǎng)至第3代，見細(xì)胞呈成纖維細(xì)胞樣、貼壁生長。(2)流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果示細(xì)胞CD29(100％)，CD44(99.99％) CD73(99.97％)，CD90(99.98％)，CD105(99.89％)呈陽性表達(dá)，而CD34(0.40％)、CD45(0.28％

11、)陰性表達(dá)。符合MSCs表型的標(biāo)準(zhǔn)。(3)細(xì)胞經(jīng)成脂誘導(dǎo)到14天時(shí)可以發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)大而圓的脂滴，證明細(xì)胞能分化為脂肪細(xì)胞。細(xì)胞經(jīng)成骨誘導(dǎo)第21天后，可見大量紅染的鈣化結(jié)節(jié)，證明細(xì)胞能分化為骨細(xì)胞。(4) AA患者外周血中TNF-α， IFN-γ的表達(dá)水平較健康人有明顯增高，T細(xì)胞亞群檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AA患者Th1明顯高于正常人;Th2比例與健康人相比則是顯著降低。同時(shí)有，Treg下調(diào)，Th17顯著升高。(5)正常人骨髓MSCs分泌的外泌體近

12、似圓形，直徑在40nm-160nm之間，表達(dá)表面標(biāo)志CD9，CD63，CD81;其蛋白分泌量與接種細(xì)胞數(shù)呈線性關(guān)系，可抑制PBMC分泌IL-1β，TNF-α，促進(jìn)TGF-β的分泌，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。exosomes對(duì)PBMCs和CD3+T細(xì)胞的增殖沒有影響。但其可明顯促進(jìn)PBMCs和CD3+T細(xì)胞的凋亡。并促進(jìn)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)的比例上調(diào)，以及其表面CTLA-4的表達(dá)，與不加exosome組對(duì)比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意

13、義(p＜0.05)。同時(shí)誘導(dǎo)Th1轉(zhuǎn)變?yōu)門h2細(xì)胞，抑制Th17細(xì)胞的分化。Ehrlich試劑盒檢測(cè)培養(yǎng)上清中IDO的表達(dá)水平時(shí)，結(jié)果表明，exosomes發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能并不是通過與MSCs細(xì)胞依賴型的調(diào)節(jié)模式機(jī)制一致，其中IDO的表達(dá)未見差異改變(p＞0.05)。
　　結(jié)論:1)AA患者的免疫系統(tǒng)失平衡，表現(xiàn)為免疫功能亢進(jìn);2）MSC來源的exosome具有類似與MSCs的免疫調(diào)節(jié)功能;3) MSC來源的exosome發(fā)揮免疫