骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對終末期肝病的抗炎免疫調(diào)節(jié)及機制研究.pdf

1、終末期肝病如急性肝衰竭(Acute liver failure，ALF)和肝硬化臨床治療手段有限，死亡率高，嚴(yán)重危害著人類健康。近年來研究提示間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)移植治療終末期肝病安全有效，但其機制尚不明確。本實驗通過研究MSCs的生物學(xué)特性、動物及臨床終末期肝病體外體內(nèi)的免疫效應(yīng)及機制，為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BM-MSCs)移植治療終末期肝病提供更好的理論依據(jù)。
　　本實驗第一部分

2、首先成功分離了大鼠骨髓和人骨髓來源的MSCs，然后分別行形態(tài)學(xué)、表型標(biāo)記及多向分化功能鑒定。結(jié)果顯示，大鼠和人骨髓來源的MSCs形態(tài)均一、梭形、集落狀或漩渦狀生長，表型標(biāo)記流式測定示高表達(dá)CD44，CD13，CD29，CD105，CD73，CD90等表面分子，而其他表面標(biāo)記如HLA-DR，CD34，CD49d，CD31，CD45則為陰性。誘導(dǎo)分化結(jié)果顯示兩種不同來源的MSCs均可以分別向成骨和成脂細(xì)胞分化。
　　第二部分是在動物水

3、平研究MSCs移植對ALF大鼠的免疫調(diào)節(jié)作用。本實驗通過將大鼠骨髓來源的MSCs經(jīng)尾靜脈、門靜脈途徑移植，觀察兩種不同途徑移植對肝功能、肝組織病理改善及肝再生指標(biāo)PCNA的表達(dá)影響，探討了免疫細(xì)胞Treg細(xì)胞的比例變化，同時也初步研究了兩種途徑移植的細(xì)胞歸巢情況。結(jié)果顯示干細(xì)胞移植組丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、總膽紅素(TBil)較對照組出現(xiàn)顯著的改善(P＜0.05)。同樣肝組織病理改善狀況移植組優(yōu)于對照組。提示MSCs移植可以改善AL

4、F肝功能和病理變化。另外研究發(fā)現(xiàn)ALF大鼠外周血中調(diào)節(jié)T細(xì)胞(Regulatory T cell， Treg)細(xì)胞比例的變化在四組中均有顯著升高(P＜0.05)，移植組24-72小時升高較對照組更為顯著。其變化與肝再生指標(biāo)增殖細(xì)胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen， PCNA)變化相一致，提示MSCs移植可能通過改善免疫環(huán)境從而促進(jìn)肝臟的再生，改善肝功能和病理組織。另外研究亦表明門靜脈組MSCs

5、歸巢優(yōu)于尾靜脈移植組，提示門靜脈途徑可能更好。
　　第三部分是關(guān)于乙肝肝硬化患者骨髓來源的MSCs與自體CD4+T細(xì)胞體外共培養(yǎng)的實驗研究。通過該臨床研究比較了乙肝肝硬化和正常對照組之間MSCs對自體CD4+T細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)差異。酶聯(lián)免疫吸附測定法(Enzyme LinkedImmunosorbent Assay，ELISA)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，炎癥細(xì)胞因子IL-6、TNF-α、IL-17在乙肝肝硬化組的培養(yǎng)上清液中含量均顯著高于正常組(P

6、＜0.05)。經(jīng)過與不同比例BM-MSCs共培養(yǎng)72h后，乙肝肝硬化組TNF-α、IL-17出現(xiàn)顯著性下降(P＜0.05)。上述研究提示MSCs具有抑炎作用，而且該作用隨細(xì)胞比例的增加而增強。但在正常對照組，MSCs并沒有顯著降低IL-17、TNF-α的含量。IL-6水平在正常對照共培養(yǎng)組出現(xiàn)顯著性升高(P＜0.05)，而這種作用在乙肝肝硬化組中不明顯。TGF-β水平在乙肝肝硬化共培養(yǎng)組出現(xiàn)顯著升高，并具有劑量依賴性，與正常對照組相比，

7、差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。熒光定量PCR結(jié)果示在乙肝肝硬化組CD4+T細(xì)胞內(nèi)Treg細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子3(Forkheadbox protein3，F(xiàn)oxP3)mRNA的表達(dá)顯著增加，1∶40組增加最明顯，而同時Th17細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子維甲酸相關(guān)孤獨受體γt(retinoid related orphanreceptor gammat，RORγ t)mRNA的表達(dá)則隨比例的增加顯著降低(P＜0.05)。而正常對照

8、組，F(xiàn)oxP3mRNA的表達(dá)稍有增加，但無統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05); RORγ t mRNA的表達(dá)與乙肝肝硬化組相反，隨著比例的加大，反而出現(xiàn)升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。提示MSCs的免疫調(diào)節(jié)功能與其所處的微環(huán)境密切相關(guān)，在不同的微環(huán)境下可能存在不同的免疫調(diào)節(jié)功能，而其分泌的細(xì)胞因子對調(diào)節(jié)其免疫效應(yīng)具有重要作用。
　　本實驗第四部分是自體骨髓干細(xì)胞移植對乙肝肝硬化Treg/Th17細(xì)胞失衡的免疫調(diào)節(jié)作用及機制研究。通

9、過將自體骨髓干細(xì)胞移植至乙肝肝硬化患者體內(nèi)，隨訪24周。81例納入評估的患者中，最后有39例完成隨訪，其中移植組（干細(xì)胞移植+恩替卡韋0.5mg/天）20例，對照組（恩替卡韋0.5mg/天）19例。盡管兩組患者的肝功能均有改善，隨訪結(jié)果示移植組ALB、TBil及終末期肝病模型(Model For End Stage Liver Disease，MELD)評分的改善較對照組明顯(P＜0.05)。流式細(xì)胞儀檢測外周單個核細(xì)胞(Periphe

10、ral blood mononuclearcells，PBMCs)中Treg/Th17比例變化，發(fā)現(xiàn)自體骨髓干細(xì)胞移植可以顯著提高Treg細(xì)胞比例及其特異性轉(zhuǎn)錄因子FoxP3基因的表達(dá)，抑制Th17細(xì)胞分化及其特異性轉(zhuǎn)錄因子RORγ t基因的表達(dá)(P＜0.05)。另外ELISA結(jié)果提示移植組炎癥細(xì)胞因子如IL-17、TNF-α及IL-6較對照組下降顯著(P＜0.05)，而TGF-β水平在移植組1、2、4周出現(xiàn)顯著性升高(P＜0.05)。