人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)大鼠膠原性關(guān)節(jié)炎的療效及免疫調(diào)節(jié)作用.pdf

1、目的:類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（Rheumatoid arthritis，RA）是由免疫活性細(xì)胞和多種細(xì)胞因子介導(dǎo)的慢性全身性自身免疫性疾病。近年來間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stemcells，MSCs)的免疫調(diào)節(jié)作用在自身免疫病中的應(yīng)用頗受關(guān)注。人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞(human amniotic mesenchymal stem cells，hAMSCs)是否通過免疫調(diào)節(jié)發(fā)揮對(duì)RA的治療作用尚不清楚。本研究以大鼠膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(Col

2、lagen-inducedarthritis，CIA)為模型，研究hAMSCs移植對(duì)CIA的治療效應(yīng)及免疫調(diào)節(jié)作用。
　　 方法:①細(xì)胞分離及鑒定:采用胰酶-膠原酶兩步消化法從足月分娩的人羊膜組織中分離人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀（Flow cytometry，F(xiàn)CM）和免疫細(xì)胞化學(xué)（Immunocytochemistry，IC）法進(jìn)行表型鑒定和細(xì)胞鑒定。②尾根部皮內(nèi)多點(diǎn)注射牛Ⅱ型膠原(CollagenⅡ，CⅡ)和完全弗氏佐

3、劑(Complete Freund's Adjuvant，CFA)的混合乳劑誘導(dǎo)Wistar大鼠CIA模型。模型動(dòng)物48只隨機(jī)分為四組:模型組(n=12);培養(yǎng)基對(duì)照組(n=12)雙側(cè)踝關(guān)節(jié)腔注射等體積無血清L-DMEM培養(yǎng)基100μl; hAMSCs治療組經(jīng)雙側(cè)踝關(guān)節(jié)腔移植（n=12，1×106cells/100μl）;氨甲蝶呤（Methotrexate，MTX）治療組腹腔注射藥物（n=12，750μg/kg，每周一次，接連4周）。各

4、組分別于2W和4W各處死6只。末次免疫后雙盲法每3天觀察大鼠足趾紅腫程度并測量足趾腫脹度，持續(xù)觀察4W。③FCM檢測hAMSCs移植后2W和4W各組外周血單個(gè)核細(xì)胞中CD4+IFN-γ+(Th1)、CD4+IL-4+(Th2)、CD4-CD8+IFN-γ+(CTL1)、CD4-CD8+IL-4+(CTL2)、CD4+Foxp3+(Treg)、CD4+IL-17+(Th17)、CD3+CD16+CD56+(NKT)、CD161+(NK)及

5、CD45RA+(B)亞群百分率的變化。④流式細(xì)胞微球芯片捕獲（Cytometric Bead Array，CBA）技術(shù)檢測血漿細(xì)胞因子IL-2、IL-4、IL-10、TNF-α和IFN-γ含量。⑤免疫熒光染色檢測細(xì)胞移植后2W和4W CIA大鼠踝關(guān)節(jié)供體細(xì)胞的存活情況。
　　 結(jié)果:①FCM和IC分析結(jié)果顯示hAMSCs高表達(dá)CD44、CD29、CD90、CD73、CD105及波形蛋白陽性，不表達(dá)CD34、CD45、CD19、C

6、D14、CD80、CD86和HLA-DR。②與模型組和培養(yǎng)基組比較，hAMSCs治療組和MTX治療組治療后第4d起AI和足趾容積值均明顯下降(P＜0.05)，踝關(guān)節(jié)X線和病理結(jié)果顯示關(guān)節(jié)骨質(zhì)破壞和炎癥反應(yīng)減輕。③與模型組和培養(yǎng)基組比較，hAMSCs治療組Th1、Th2、Th17、CTL1、CTL2和NKT亞群百分比明顯下降，而Foxp3+Treg細(xì)胞顯著上調(diào)（P＜0.01）。hAMSCs治療組和MTX治療組淋巴細(xì)胞亞群的變化相似，但后者

7、Foxp3+Treg細(xì)胞上調(diào)幅度不及前者(P＜0.01)。④與模型組比較，hAMSCs組IL-10和IL-4明顯升高(P＜0.05)，IFN-γ和TNF-α含量下降(P＜0.05)。⑤免疫熒光染色結(jié)果顯示，踝關(guān)節(jié)腔移植后hAMSCs在踝關(guān)節(jié)組織中存活達(dá)到4W以上。
　　 結(jié)論:hAMSCs能明顯改善CIA大鼠臨床癥狀和關(guān)節(jié)病變，其機(jī)制主要與上調(diào)Foxp3+Treg和抑制Th17細(xì)胞有關(guān)，提示hAMSCs是用于RA細(xì)胞治療理想的候