骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對(duì)膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎大鼠免疫功能影響的研究.pdf

1、背景：類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種以滑膜增生、軟骨降解和骨質(zhì)破壞為特征的高度致殘性自身免疫性疾病。T、B淋巴細(xì)胞異常增殖，Th1/Th2比例失衡及其分泌的細(xì)胞因子是其主要發(fā)病機(jī)制。目前RA最佳治療策略是早期聯(lián)合改善病情抗風(fēng)濕藥物，其臨床緩解率僅40-70％，且當(dāng)病情發(fā)展至關(guān)節(jié)畸形時(shí)尚無方法修復(fù)軟骨及骨破壞。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BM

2、SCs)是一種非造血干細(xì)胞，具有自我更新、高度增殖及多向分化的能力。研究發(fā)現(xiàn)BMSCs除具有支持造血，促進(jìn)體內(nèi)造血功能重建外，尚具有免疫調(diào)節(jié)功能，故在治療自身免疫性疾病中有著廣泛的應(yīng)用前景，為RA治療開辟了新的方向。 目的：通過檢測(cè)大鼠脾臟中T細(xì)胞、B細(xì)胞的增殖情況及CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和Foxp3mRNA，觀察不同期BMSCs移植對(duì)膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎(collagen induced arthritis，CIA)大鼠脾臟

3、中免疫細(xì)胞的影響，闡述其體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)作用機(jī)制。 方法： 1．建立CIA大鼠模型：用含牛Ⅱ型膠原1mg/ml的弗氏完全佐劑(complete Freund’sadjuvant，CFA)免疫Wistar大鼠； 2．BMSCs的分離、培養(yǎng)、傳代與鑒定：密度梯度離心法結(jié)合貼壁法分離BMSCs，用含10％胎牛血清的L-DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，細(xì)胞至80％融合時(shí)按1：3傳代擴(kuò)增；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)P3代BMSCs表面抗原CD44、C

4、D71、CD31及CD45表達(dá)，進(jìn)而鑒定所培養(yǎng)細(xì)胞為BMSCs； 3．CIA大鼠分組：將40只CIA大鼠分為5組：①BMSCs早期治療組(佐劑初次誘導(dǎo)時(shí)給予BMSCs移植)；②BMSCs晚期治療組(佐劑第二次誘導(dǎo)時(shí)給予BMSCs移植)；③CIA早期對(duì)照組(佐劑初次誘導(dǎo)時(shí)給予生理鹽水)；④CIA晚期對(duì)照組(佐劑第二次誘導(dǎo)時(shí)給予生理鹽水)；⑤正常對(duì)照組； 4．異基因BMSCs移植：均采用尾靜脈注射，每只大鼠移植的細(xì)胞數(shù)為1×

5、107個(gè)/kg；對(duì)照組以同樣方法給予等容量的生理鹽水；給予BMSCs移植或生理鹽水注射后第42d處死取脾； 5．指標(biāo)檢測(cè)：通過CCK-8測(cè)定T、B淋巴細(xì)胞增殖情況；RT-PCR測(cè)定Foxp3 mRNA表達(dá)；流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，收集數(shù)據(jù)，統(tǒng)計(jì)分析。 結(jié)果： 1．BMSCs移植對(duì)CIA大鼠脾臟T淋巴細(xì)胞的影響：CIA對(duì)照組T細(xì)胞增殖水平高于正常對(duì)照組(P＜0.05)；經(jīng)BMSCs治療后T細(xì)胞

6、增殖水平明顯降低(P＜0.05)；且早期治療組低于晚期治療組(P＜0.05)。說明BMSCs抑制CIA大鼠脾臟T淋巴細(xì)胞異常增殖，早期組療效優(yōu)于晚期組。 2．BMSCs移植對(duì)CIA大鼠脾臟B淋巴細(xì)胞的影響：CIA對(duì)照組B細(xì)胞增殖水平高于正常對(duì)照組(P＜0.05)；經(jīng)BMSCs治療后B細(xì)胞增殖水平明顯降低(P＜0.05)；但早、晚期治療組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。說明BMSCs抑制CIA大鼠脾臟B淋巴細(xì)胞異常增殖。

7、 3．BMSCs移植對(duì)CIA大鼠脾臟Foxp3 mRNA表達(dá)的影響：CIA對(duì)照組Foxp3 mRNA表達(dá)水平低于正常對(duì)照組(P＜0.05)；經(jīng)BMSCs治療后Foxp3 mRNA表達(dá)水平明顯高于CIA對(duì)照組(P＜0.05)；但早、晚期治療組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。說明BMSCs上調(diào)CIA大鼠脾臟Foxp3 mRNA表達(dá)水平。 4．BMSCs移植對(duì)CIA大鼠脾臟CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的影響：CIA對(duì)照組CD4

8、+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例低于正常對(duì)照組(P＜0.05)：經(jīng)BMSCs治療后CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例明顯高于CIA對(duì)照組(P＜0.05)，且早期治療組高于晚期治療組(P＜0.05)。說明BMSCs上調(diào)CIA大鼠脾臟CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞水平，且早期組療效優(yōu)于晚期組。 結(jié)論： 異基因BMSCs移植治療CIA大鼠作用機(jī)制可能是抑制T、B淋巴細(xì)胞異常增殖、上調(diào)Foxp3 mRNA表達(dá)和CD4+CD25+調(diào)節(jié)