同種大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎的免疫治療研究.pdf

1、目的:
　　本實(shí)驗(yàn)通過(guò)制備膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎大鼠(Collagen-induced arthritis，CIA)模型，提純CIA大鼠來(lái)源BMSCs，觀察研究CIA大鼠來(lái)源的BMSCs的生物學(xué)活性和多向分化能力;通過(guò)CIA-BMSCs、SD-BMSCs與脾臟混合淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)，了解兩者對(duì)脾臟混合淋巴細(xì)胞增殖的影響和差異，以及與凋亡的關(guān)系;通過(guò)移植CIA-BMSCs至CIA大鼠體內(nèi)，觀察CIA-BMSCs對(duì)CIA大鼠足爪腫脹程度和TNF-

2、α分泌水平的影響。共同探討自體BMSCs移植治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的可能機(jī)制。
　　方法:
　　1.制作膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎大鼠模型，采用全骨髓貼壁培養(yǎng)法傳代培養(yǎng)CIA-BMSCs，觀察CIA-BMSCs的生物學(xué)活性并運(yùn)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面抗原CD34、CD45、CD90以及誘導(dǎo)CIA-BMSCs分化為成脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞。比較CIA-BMSCs與SD-BMSCs兩者的差異。
　　2.分離提取SD大鼠脾臟混合淋巴細(xì)

3、胞，分別將CIA-BMSCs培養(yǎng)上清液與脾臟混合淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)和CIA-BMSCs與脾臟混合淋巴細(xì)胞接觸性共培養(yǎng)。運(yùn)用CCK8法和MTT法檢測(cè)不同共培養(yǎng)方式對(duì)脾臟混和淋巴細(xì)胞增殖的影響，并與SD大鼠來(lái)源的BMSCs做比較。同時(shí)用Annexin V-FITC/PI雙標(biāo)法進(jìn)一步明確該影響與凋亡的關(guān)系。
　　3.CIA-BMSCs在CIA大鼠體內(nèi)移植后，運(yùn)用后肢容積排水法測(cè)定第0W、2W、4W、6W、8W、10W CIA大鼠的左足腫脹程

4、度;運(yùn)用大鼠腫瘤壞死因子αELISA試劑盒檢測(cè)在CIA-BMSCs移植后第2W、4W、6W、8W、10W大鼠體內(nèi)細(xì)胞因子TNF-α分泌水平。比較其與未移植CIA-BMSCs大鼠左足腫脹度和TNF-α分泌水平的區(qū)別。
　　結(jié)果:
　　1.CIA-BMSCs傳代后穩(wěn)定性好，純度高，可達(dá)90％以上，流式細(xì)胞儀測(cè)定CD34、45表達(dá)均小于10％（-），CD90表達(dá)大于90％(+)。與SD-BMSCs比較無(wú)明顯區(qū)別。CIA-BMSCs

5、在成骨誘導(dǎo)液作用第21d，茜素紅染色見較多致密礦化結(jié)節(jié);在成脂誘導(dǎo)液作用第10d，油紅O染色見細(xì)胞核內(nèi)有較多大而圓的脂肪滴。與SD-BMSCs相比，分化能力略差。在成軟骨誘導(dǎo)液作用下CIA-BMSCs微團(tuán)培養(yǎng)第21d將細(xì)胞重懸種植在激光共聚焦專用皿中，繼續(xù)培養(yǎng)3d后抗Ⅱ型膠原抗體染色陽(yáng)性。
　　2.CCK8法檢測(cè)CIA-BMSCs培養(yǎng)上清液對(duì)脾臟混合淋巴細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組CIA-BMSCs細(xì)胞第12h、24h、36h

6、、48h的OD值較空白對(duì)照組大，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，與SD-BMSCs組相比無(wú)明顯差異（P＞0.05）;MTT法檢測(cè)CIA-BMSCs與脾臟混合淋巴細(xì)胞接觸性共培養(yǎng)時(shí)對(duì)脾臟混合淋巴細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞第1d、2d、3d、4d、5d的細(xì)胞OD值較空白對(duì)照組小，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);與SD-BMSCs組相比無(wú)明顯差異（P＞0.05）。Annexin V-FITC/PI雙標(biāo)法檢測(cè)接觸性共培養(yǎng)條

7、件下脾臟混合淋巴細(xì)胞的凋亡情況，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組與空白對(duì)照組相比，凋亡率差異性無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　3.實(shí)驗(yàn)組CIA-BMSCs體內(nèi)移植后，TNF-α分泌量分別為2W73.71pg/ml、4W84.05pg/ml、6W91.50pg/ml、8W89.60pg/ml、10W99.24pg/ml，對(duì)照組A（未移植CIA-BMSCs的CIA大鼠組）:TNF-α分泌量為2W75.38pg/ml、4W83.72pg/ml、6W107

8、.64pg/ml、8W106.5pg/ml、10W124.16pg/ml;對(duì)照組B(未移植CIA-BMSCs的SD大鼠組)TNF-α分泌量為2W43.14pg/ml、4W45.01pg/ml、6W45.89pg/ml、8W44.32pg/ml、10W42.89pg/ml相比較，發(fā)現(xiàn)各時(shí)間點(diǎn)CIA-BMSCs移植組與CIA大鼠組TNF-α分泌量均較SD大鼠組明顯增多(P＜0.05)，CIA-BMSCs移植組在移植第2W、4W時(shí)TNF-α分

9、泌量與CIA組無(wú)明顯差別(P＞0.05)，但第6W、8W、10W較CIA組分泌的TNF-α分泌量明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　結(jié)論:
　　1.通過(guò)全骨髓貼壁培養(yǎng)法能夠分離出純度較高的、具有較強(qiáng)的體外擴(kuò)增能力CIA-BMSCs;CIA-BMSCs具有成脂、成骨、成軟骨細(xì)胞的分化能力。
　　2.CIA-BMSCs對(duì)脾臟混合淋巴細(xì)胞的增殖有抑制作用，并且該抑制作用與細(xì)胞接觸密切相關(guān)，與促進(jìn)淋巴細(xì)胞凋亡無(wú)關(guān)