人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞微泡對膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎大鼠Treg-Th17及相關(guān)炎癥因子的影響.pdf

1、背景：
　　類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)發(fā)病機(jī)制尚不清楚，T細(xì)胞及其亞群成為介導(dǎo)其致病過程的主要炎癥細(xì)胞，Treg/Th17失衡和疾病的發(fā)生發(fā)展與轉(zhuǎn)歸密切相關(guān)。間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells, MSCs）可通過平衡Treg/Th17失衡發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，微泡（Microvesicles, MVs）是MSCs在靜息或應(yīng)激狀態(tài)下產(chǎn)生的膜分泌體系，含有豐富的生物學(xué)信息。目前已

2、證實(shí)，其能模擬其母體細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)及組織修復(fù)作用，可能成為RA治療的新手段。
　　目的：
　　通過對RA動(dòng)物模型即膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎(Collagen-Induced Arthritis,CIA)大鼠的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究，觀察hUCMSC-MVs干預(yù)對CIA大鼠關(guān)節(jié)炎癥狀、影像學(xué)及病理變化的影響，對血清中促炎因子IL-17、抑炎因子TGF-β，脾臟T淋巴細(xì)胞增殖及凋亡指數(shù)，Treg/Th17,Treg細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子FoxP3，

3、Th17細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子ROR-γT的調(diào)節(jié)作用，探討其療效及作用機(jī)制。
　　方法：
　　1. hUCMSC-MVs的分離及鑒定：對hUCMSCs“饑餓”培養(yǎng)24小時(shí)，差速離心法提取上清液中的微泡，使用透射電鏡觀察其形態(tài)，并使用 Nano Drop2000超微量分光光度計(jì)測定其蛋白質(zhì)含量。
　　2.建立CIA模型：弗氏完全佐劑+II型膠原多點(diǎn)皮下注射免疫雌性Wistar大鼠，兩周后腹腔注射再次建立CIA大鼠模型。大鼠隨

4、機(jī)分為以下7組，每組6只，即CIA模型組，hUCMSCs組，hUCMSC-MVs低、中及高濃度組，同時(shí)設(shè)立MTX組及正常對照組。
　　3.給藥方法：再次免疫后次日進(jìn)行干預(yù)。hUCMSCs尾靜脈移植2×106/kg/鼠， hUCMSC-MVs分別尾靜脈注射30ug/100μl、60ug/100μl及90ug/100μl/鼠，對照組給予等量的生理鹽水，MTX組給予MTX0.9mg/kg/w腹腔注射。
　　4.檢測指標(biāo)：初次免疫后

5、每周對各組大鼠體重、關(guān)節(jié)炎指數(shù)和后足腫脹度進(jìn)行測定，42天時(shí)，留取后足影像學(xué)資料、外周血、脾臟及后足踝關(guān)節(jié)，流式多因子檢測技術(shù)檢測血清中IL-17、TGF-β的表達(dá)水平，流式細(xì)胞術(shù)檢測脾臟T細(xì)胞增殖及凋亡指數(shù)，Treg、Th17細(xì)胞水平；同時(shí)對各組脾臟及關(guān)節(jié)組織制作病理切片，觀察關(guān)節(jié)病理變化；免疫組織化學(xué)技術(shù)觀察脾臟的Fox-P3及ROR-γT的表達(dá)情況，收集數(shù)據(jù)做統(tǒng)計(jì)分析。
　　結(jié)果：
　　1. hUCMSC-MVs的鑒定

6、及對膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎大鼠一般情況的影響
　?。?）hUCMSC-MVs的鑒定透射電鏡觀察，MVs為一類直徑介于30nm-200nm之間大小不一的囊泡狀結(jié)構(gòu)，蛋白質(zhì)濃度約為2.05μg/μl，符合目前國際公認(rèn)的鑒定MSC-MVs的標(biāo)準(zhǔn)。
　?。?）hUCMSC-MVs對CIA大鼠體重的影響與正常對照組比較，CIA模型組大鼠體重增長程度明顯降低（P<0.05），干預(yù)后有所改善，hUCMSC-MVs高濃度組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05

7、），且高于低濃度組（P<0.05）。
　?。?）hUCMSC-MVs對CIA大鼠關(guān)節(jié)炎癥狀的影響 CIA模型組大鼠后足較正常對照組腫脹明顯（P<0.05），關(guān)節(jié)炎指數(shù)明顯升高（P<0.05）。各干預(yù)組后足腫脹有所減輕，關(guān)節(jié)炎指數(shù)下降，42天時(shí)僅MTX組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。
　?。?）hUCMSC-MVs對CIA大鼠踝關(guān)節(jié)影像學(xué)的影響與正常對照組比較，CIA模型組大鼠關(guān)節(jié)X線表現(xiàn)為關(guān)節(jié)間隙模糊，甚至狹窄，出現(xiàn)骨髓疏松

8、，加強(qiáng)免疫后可見踝關(guān)節(jié)有蟲蝕樣破壞。干預(yù)后關(guān)節(jié)破壞有所修復(fù)，關(guān)節(jié)間隙及骨質(zhì)疏松較前有所減輕，且高濃度組療效明顯，與hUCMSCs組及MTX組接近。
　?。?）hUCMSC-MVs對CIA大鼠踝關(guān)節(jié)病理的影響健康對照組大鼠關(guān)節(jié)腔結(jié)構(gòu)清晰，無或少量滑膜增生及炎性細(xì)胞浸潤；CIA模型組滑膜增生明顯，大量炎性細(xì)胞浸潤，部分出現(xiàn)軟骨破壞。各干預(yù)組滑膜增生及炎性細(xì)胞浸潤明顯減少，且高濃度組優(yōu)于hUCMSCs及MTX組。
　　2. hUC

9、MSC-MVs對膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎大鼠Treg/Th17及炎癥因子的影響
　?。?）hUCMSC-MVs對CIA大鼠血清IL-17及TGF-β等炎癥因子的影響 CIA模型組IL-17水平較正常對照組明顯升高（P<0.05）,TGF-β水平有所下降。hUCMSC-MVs高濃度組IL-17水平與hUCMSCs及MTX組接近（P>0.05），明顯低于低中濃度組（P<0.05）。中高濃度組、hUCMSCs及MTX組TGF-β水平接近（P<0.

10、05）。
　?。?）hUCMSC-MVs對CIA大鼠脾臟T淋巴細(xì)胞的影響 CIA模型組T淋巴細(xì)胞增殖水平高于正常對照組(P<0.05）；高濃度組與hUCMSCs組接近，高于MTX組（P<0.05）。CIA模型組T淋巴細(xì)胞凋亡水平明顯降低（P<0.05）；各干預(yù)組均有所下降，且高濃度組、hUCMSCs及MTX組水平接近（P>0.05）。
　?。?） hUCMSC-MVs對CIA大鼠脾臟CD4+CD25+FoxP3+Treg細(xì)胞

11、、Th17細(xì)胞及Treg/Th17的影響與正常對照組比較，CIA模型組大鼠脾臟Th17細(xì)胞水平明顯升高（P<0.05），Treg/Th17明顯降低（P<0.05），而CD4+CD25+FoxP3+Treg細(xì)胞水平有所降低，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。各干預(yù)組Th17細(xì)胞水平均明顯降低， Treg/Th17升高（P<0.05），中高濃度組對Th17細(xì)胞及Treg/Th17的調(diào)節(jié)能力與MTX組接近，優(yōu)于低濃度組（P<0.05），且高濃度

12、組抑制Th17細(xì)胞的能力優(yōu)于hUCMSCs組（P<0.05）。hUCMSC-MVs高濃度組上調(diào)CD4+CD25+FoxP3+Treg水平的能力與hUCMSCs、MTX組接近（P>0.05），優(yōu)于低、中濃度組（P<0.05）。
　　（4）hUCMSC-MVs對CIA大鼠脾臟Foxp3及ROR-γT表達(dá)的影響 CIA大鼠脾臟ROR-γT的表達(dá)較正常對照組明顯升高（P<0.05），F(xiàn)oxP3水平明顯下降（P<0.05）。經(jīng)hUCMSC-

13、MVs干預(yù)后，ROR-γT表達(dá)明顯降低，F(xiàn)oxP3水平升高（P<0.05），且高濃度組優(yōu)于低中濃度組（P<0.05）。在調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子ROR-γT方面，hUCMSC-MVs高濃度組與hUCMSCs組接近（P>0.05），優(yōu)于MTX組（P<0.05）；而在調(diào)節(jié)FoxP3方面，hUCMSC-MVs高濃度組均優(yōu)于hUCMSCs及MTX組（P<0.05）。
　　結(jié)論：
　　1. hUCMSC-MVs明顯改善CIA大鼠體重減輕，抑制關(guān)節(jié)

14、滑膜增生及炎癥細(xì)胞浸潤，發(fā)揮抗炎及組織修復(fù)作用。
　　2. hUCMSC-MVs通過抑制CIA大鼠脾臟T淋巴細(xì)胞增殖、促進(jìn)凋亡，上調(diào)CD4+CD25+FoxP3+Treg水平，下調(diào)Th17細(xì)胞水平，平衡Treg/Th17比例發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，高濃度組不弱于hUCMSCs組，甚至在下調(diào)Th17方面更有優(yōu)勢；除對T細(xì)胞增殖的抑制作用弱于MTX組，余作用與其相當(dāng)。
　　3. hUCMSC-MVs抑制CIA大鼠脾臟ROR-γT，促進(jìn)