人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞微泡對(duì)膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎大鼠的骨保護(hù)作用及對(duì)其RANKL-OPG系統(tǒng)失衡作用機(jī)制的研究.pdf

1、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種以侵蝕性、對(duì)稱性多關(guān)節(jié)炎為主要臨床表現(xiàn)的自身免疫性疾病。研究表明RANKL/OPG比例失衡是RA骨侵蝕和破壞的一個(gè)重要機(jī)制。目前的治療方法尚不能對(duì)RA的骨破壞進(jìn)行有效修復(fù)，因此急需尋找一種可以抑制RA骨破壞進(jìn)展的新型治療藥物。MSC-MVs（mesenchymal stem cell-derived microvesicle）是MSCs在靜息或應(yīng)激狀態(tài)下產(chǎn)生的異質(zhì)性膜分

2、泌體系，目前已證實(shí)，MSC-MVs能模擬其母體細(xì)胞的組織修復(fù)作用，可能成為抑制RA骨破壞進(jìn)展的治療新手段。
　　目的：
　　觀察尾靜脈注射人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞微泡（hUCMSC-MVs）對(duì)CIA大鼠模型的干預(yù)效果，評(píng)估其對(duì) CIA大鼠骨密度的影響，并在血清及組織水平探討hUCMSC-MVs對(duì)CIA大鼠骨代謝因子RANKL、OPG水平的影響。
　　方法：
　　1.采用組織塊培養(yǎng)方法體外分離、培養(yǎng)hUC-MSCs，流式

3、細(xì)胞術(shù)檢測(cè)表面抗原 CD29、CD44、CD105、CD73、CD90、CD166、CD34、CD45，在特定條件下對(duì)hUC-MSCs的成骨、成脂分化潛能進(jìn)行鑒定；對(duì)hUC-MSCs“饑餓”培養(yǎng)24小時(shí)，使用差速離心提取上清液中的微泡，使用透射電鏡觀察其形態(tài)，并使用Nano Drop2000超微量分光光度計(jì)測(cè)定其蛋白質(zhì)含量。
　　2.將54只體重及鼠齡相當(dāng)?shù)?Wistar大鼠隨機(jī)分為2組，正常對(duì)照組(6只)和造模組（48只），造模

4、組用牛II型膠原和弗氏完全佐劑乳化液2次免疫動(dòng)物，建立CIA大鼠模型，造模成功（36只）后隨機(jī)分為CIA組6只、MTX組6只、hUCMSCs組6只、hUCMSC-MVs低濃度組6只、hUCMSC-MVs中濃度組6只、hUCMSC-MVs高濃度組6只。MTX組腹腔注射0.9mg/kg，每周1次，共3周。MSC組尾靜脈注射2×106個(gè)MSCs/100μl鹽水，1次。hUCMSC-MVs低、中、高濃度組分別經(jīng)尾靜脈注射30、60、90ug h

5、UCMSC-MVs/100μl鹽水，1次。
　　3.分別通過(guò)測(cè)量雙足腫脹度、關(guān)節(jié)炎指數(shù)、影像學(xué)及病理學(xué)評(píng)分對(duì)CIA大鼠的干預(yù)效果進(jìn)行評(píng)估；為初步探究hUCMSC-MVs對(duì)CIA大鼠骨密度的影響，本研究分別從每組大鼠中各選取1只大鼠進(jìn)行Micro-CT掃描，對(duì)掃面所得斷層圖像進(jìn)行三位重建及骨參數(shù)分析。
　　4.使用高通量流式多因子檢測(cè)技術(shù)測(cè)定各組大鼠血清中RANKL、OPG的表達(dá)水平。應(yīng)用免疫組化技術(shù)檢測(cè)各組大鼠滑膜組織RAN

6、KL、OPG的表達(dá)水平。
　　結(jié)果：
　　1. hUCMSC的分離及鑒定：hUCMSCs呈比較均一的，沿一定方向排列的，梭形的成纖維細(xì)胞樣生長(zhǎng)，CD29、CD44、CD105、CD73、CD90和CD166陽(yáng)性， CD34、CD45陰性，符合間充質(zhì)干細(xì)胞的國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)。透射電鏡觀察，顯示離心所得產(chǎn)物為一類直徑介于30nm-200nm之間大小不一的囊泡狀結(jié)構(gòu)，符合目前國(guó)際公認(rèn)的鑒定MSC-MVs的標(biāo)準(zhǔn)。
　　2. CIA大鼠

7、造模成功率達(dá)83.3％(40／48)。癥狀、雙足腫脹度、關(guān)節(jié)炎指數(shù)、影像學(xué)、病理評(píng)估證實(shí)造模成功，為慢性關(guān)節(jié)炎。
　　3. hUCMSC-MVs干預(yù)CIA大鼠后的效果評(píng)估：
　　（1）關(guān)節(jié)炎指數(shù)(AI)：初次免疫后，各造模組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)進(jìn)行性升高，初次免疫后14d對(duì)CIA大鼠進(jìn)行干預(yù)后關(guān)節(jié)炎指數(shù)逐漸下降。初次免疫后42天， CIA組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)仍顯著高于正常對(duì)照組（p<0.05），各干預(yù)組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)有所降低，其中MT

8、X組關(guān)節(jié)炎指數(shù)最低，且僅MTX組與CIA組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05）。提示在改善關(guān)節(jié)炎指數(shù)方面， MTX組療效最顯著， hUCMSC-MVs及hUCMSCs組療效均不顯著。
　?。?）關(guān)節(jié)X線改變：與正常對(duì)照組相比，CIA模型組大鼠關(guān)節(jié)X線表現(xiàn)為關(guān)節(jié)間隙模糊，甚至狹窄，有骨質(zhì)疏松的出現(xiàn)，加強(qiáng)免疫后可見(jiàn)踝關(guān)節(jié)有蟲蝕樣破壞。hUCMSC-MVs、hUCMSCs及MTX治療后關(guān)節(jié)破壞有所修復(fù)，關(guān)節(jié)間隙較前略有所減輕，且各實(shí)驗(yàn)組對(duì)其

9、改善程度相近。
　?。?）HE關(guān)節(jié)病理改變：CIA組大鼠的滑膜層次增多，可達(dá)10-20層，排列紊亂，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，軟骨、骨組織嚴(yán)重侵蝕；hUCMSC-MVs低濃度組滑膜增生、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、軟骨及骨組織侵蝕有所減輕；hUCMSCs組、MTX組及hUCMSC-MVs中、高濃度組滑膜增生、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、軟骨及骨組織侵蝕明顯改善。
　　4. hUCMSC-MVs對(duì)CIA大鼠骨密度的影響：
　　（1）Micro-CT檢測(cè)大鼠

10、踝關(guān)節(jié)骨密度改變：CIA組大鼠可見(jiàn)明顯骨質(zhì)疏松，各干預(yù)組大鼠骨質(zhì)疏松程度均較CIA組大鼠明顯改善，hUCMSC-MVs高濃度組大鼠骨密度與hUCMSCs組及MTX組大鼠相近；
　?。?）骨參數(shù)改變：CIA組大鼠BV/TV、Tb．N及Tb．Th值低于正常對(duì)照組大鼠，Tb．Sp值高于正常對(duì)照組大鼠；各干預(yù)組大鼠BV/TV、Tb．N及Tb．Th值高于CIA組大鼠，Tb．Sp值低于CIA組大鼠。
　　5. hUCMSC-MVs對(duì)CI

11、A大鼠RANKL/OPG系統(tǒng)失衡的影響：
　?。?）CIA組血清 RANKL水平顯著增高，OPG水平顯著降低(P<0.05)。與CIA組相比，hUCMSC-MVs中、高濃度組、hUCMSCs組及MTX組血清中RANKL表達(dá)水平降低，OPG表達(dá)水平升高（P＜0.005）；hUCMSC-MVs高濃度組血清RANKL值略高于MTX組及hUCMSCs組，OPG值略低于MTX組及hUCMSCs組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

12、　　（2）CIA組踝關(guān)節(jié)滑膜組織 RANKL水平顯著增高，OPG水平顯著降低(P<0.05)。與CIA組相比，hUCMSC-MVs中、高濃度組、hUCMSCs組及MTX組踝關(guān)節(jié)滑膜組織中 RANKL表達(dá)水平降低， OPG表達(dá)水平升高(P<0.05)。hUCMSC-MVs低濃度組與CIA組踝關(guān)節(jié)滑膜組織RANKL及OPG表達(dá)水平相近(P>0.05)。hUCMSC-MVs高濃度組與hUCMSCs組及MTX組踝關(guān)節(jié)滑膜組織RANKL及OPG表

13、達(dá)水平相近(P>0.05)。
　　結(jié)論：
　　1. hUCMSC-MVs可改善CIA大鼠的病理學(xué)改變，但尚不足以顯著改善其關(guān)節(jié)炎癥狀。
　　2. CIA大鼠骨破壞系統(tǒng)發(fā)生紊亂，RANKL/OPG系統(tǒng)失衡參與了其骨破壞的發(fā)生發(fā)展。
　　3. hUCMSC-MVs可改善CIA大鼠的骨質(zhì)疏松程度，并可通過(guò)降低血清及關(guān)節(jié)滑膜組織中的RANKL水平，升高OPG水平而達(dá)到調(diào)節(jié)骨破壞系統(tǒng)紊亂的作用。
　　4.高濃度 hU