非T細(xì)胞結(jié)合肽對(duì)膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎大鼠的治療作用及其機(jī)制研究.pdf

1、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA）是一種常見的自身免疫性疾病。目前其病因仍不清楚，但深入研究表明T細(xì)胞在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用。膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎模型由于其引起的免疫機(jī)制和關(guān)節(jié)病理與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎相似，被廣泛地應(yīng)用于RA機(jī)制研究及關(guān)節(jié)炎治療藥物的篩選。
　　變構(gòu)肽在自身免疫疾病中的免疫調(diào)節(jié)作用研究已有一定基礎(chǔ)。Ⅱ型膠原(CⅡ)是涉及RA發(fā)病機(jī)制的重要的自身抗原。非T細(xì)胞結(jié)合肽(Non-T cellbinding peptide，NTA

2、P)是一種CⅡ263-272特定表位的變構(gòu)肽，采用甘氨酸或丙氨酸替換了類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎主要抗原的疾病相關(guān)肽段CⅡ263-272抗原肽上能夠與TCR結(jié)合的氨基酸，保留CⅡ263-272抗原肽上能與RA相關(guān)的MHCⅡ類分子結(jié)合的氨基酸。本研究采用膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎大鼠模型，觀察TAP對(duì)關(guān)節(jié)炎的治療作用，并且從輔助性T細(xì)胞亞群和相關(guān)細(xì)胞因子，以及凋亡等方面來探討NTAP的作用機(jī)制。
　　第一部分、非T細(xì)胞結(jié)合肽對(duì)膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎大鼠的治療作用<

3、br>　　目的:觀察NTAP對(duì)膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎大鼠的治療作用。
　　方法:選擇6-7周齡的Lewis雌性大鼠，隨機(jī)分為對(duì)照組和CIA模型組。CIA模型組大鼠于尾根部皮內(nèi)注射牛Ⅱ型膠原與不完全弗氏佐劑配制的乳劑，7天后同法加強(qiáng)免疫1次。成模大鼠隨機(jī)分為模型組、NTAP組、原型肽組和無關(guān)肽組，模型組、NTAP組每組10只，原型肽組、無關(guān)肽組每組8只。尾靜脈注射給藥，給藥劑量分別為1mg/kg，1.07 mg/kg和1 mg/kg，隔天一

4、次，連續(xù)兩周。模型組和對(duì)照組以相同方法和體積注射PBS。給藥期間進(jìn)行關(guān)節(jié)炎癥評(píng)分，給藥結(jié)束后144h處死大鼠，X光檢查大鼠后爪的跖骨變化，HE染色法觀察滑膜組織形態(tài)學(xué)變化，免疫組織化學(xué)法檢測(cè)IL-17在關(guān)節(jié)滑膜的的定位和表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1.與模型組比較，NTAP組關(guān)節(jié)炎評(píng)分明顯改善（P＜0.01）;X光檢查評(píng)分有差異。
　　2.HE染色結(jié)果顯示，對(duì)照組大鼠滑膜由1～2層扁平滑膜細(xì)胞及滑膜下層組成，無炎性細(xì)胞浸潤

5、及纖維增生。規(guī)整平滑，細(xì)胞間連接緊密，方向一致。與對(duì)照組大鼠滑膜相比，CIA大鼠滑膜內(nèi)襯層細(xì)胞增殖，層數(shù)增多，細(xì)胞間隙增寬，排列紊亂，呈現(xiàn)典型的柵欄樣結(jié)構(gòu)，襯里下層區(qū)域多種炎性細(xì)胞彌漫性浸潤，血管增生明顯，結(jié)締組織脂肪細(xì)胞增多。和模型組大鼠相比，NTAP組大鼠滑膜層數(shù)減少，排列趨于整齊，炎性細(xì)胞浸潤和滑膜增生減少。與對(duì)照組大鼠滑膜相比，模型組滑膜組織中IL-17表達(dá)明顯升高(P＜0.01）。與模型組比較，NTAP組IL-17表達(dá)明顯降低

6、(P＜0.01)，原型肽組和無關(guān)肽組亦明顯降低（P＜0.01）。
　　結(jié)論:NTAP可明顯改善關(guān)節(jié)炎指數(shù)，改善滑膜病理和跖骨損傷，降低滑膜組織IL-17表達(dá)，表明NTAP對(duì)膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎大鼠具有一定的治療作用。
　　第二部分、非T細(xì)胞結(jié)合肽對(duì)膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎大鼠輔助性T細(xì)胞亞群的影響
　　目的:觀察NTAP對(duì)膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎大鼠輔助性T細(xì)胞亞群和相關(guān)細(xì)胞因子與轉(zhuǎn)錄因子的影響，并探討其作用機(jī)制。
　　方法:采用流式細(xì)胞

7、術(shù)測(cè)定脾臟中Th1、Th2、Th17和Treg的細(xì)胞水平。RT-PCR法測(cè)定脾臟中Th1、Th2、Th17、Treg相關(guān)的主要轉(zhuǎn)錄因子T-bet、Gata-3、RORγt及Foxp3 mRNA的表達(dá)，以及Th1、Th2、Th17、Treg標(biāo)志性細(xì)胞因子IFN-γ、 IL-4、IL-17、TGF-β的mRNA表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1.與對(duì)照組比較，模型組Th1、Th17細(xì)胞比例及Th1/Th2細(xì)胞比值明顯升高，Th2、Tre

8、g細(xì)胞比例明顯降低(P＜0.01);與模型組比較，NTAP組Th1、Th17細(xì)胞比例及Th1/Th2細(xì)胞比值明顯降低，Treg細(xì)胞比例明顯升高(P＜0.01)，原型肽組Th2細(xì)胞明顯升高，Th17細(xì)胞明顯降低(P＜0.05)，無關(guān)肽組Th17細(xì)胞明顯降低(P＜0.01)。
　　2.與對(duì)照組比較，模型組大鼠脾臟中IFN-γ、IL-17、IL-4 mRNA表達(dá)明顯升高，TGF-β mRNA表達(dá)明顯降低(P＜0.01)。與模型組比較，N

9、TAP組大鼠脾臟中IFN-γ、IL-17 mRNA表達(dá)明顯降低(P＜0.01)，IL-4、TGF-βmRNA表達(dá)明顯升高(P＜0.05，P＜0.01);與模型組比較，原型肽組大鼠脾臟中IL-17 mRNA表達(dá)明顯降低(P＜0.01)，無關(guān)肽組大鼠脾臟中IL-17mRNA表達(dá)也明顯降低(P＜0.01)。
　　3.與對(duì)照組比較，模型組大鼠脾臟中T-bet、RORγt mRNA表達(dá)明顯升高，Gata-3、Foxp3 mRNA表達(dá)明顯降低

10、(P＜0.01)。與模型組比較，NTAP組大鼠脾臟中T-bet、RORγt mRNA表達(dá)明顯下調(diào)，Gata-3、Foxp3mRNA表達(dá)明顯上升(P＜0.01);原型肽組大鼠脾臟細(xì)胞中T-bet、Foxp3mRNA表達(dá)明顯降低(P＜0.01)，RORγt mRNA表達(dá)與模型組大鼠比較沒有差異，而Gata-3 mRNA表達(dá)明顯升高(P＜0.01);無關(guān)肽組大鼠脾臟中RORγt mRNA表達(dá)明顯下降(P＜0.01)。
　　結(jié)論:NTAP

11、可調(diào)節(jié)大鼠脾臟T細(xì)胞Th1、Th2、Th17及Treg四種亞型的比例，抑制CD4+T細(xì)胞向Th1和Th17細(xì)胞分化，促進(jìn)其向Th2和Treg細(xì)胞分化。下調(diào)Th1、Th17細(xì)胞的主要轉(zhuǎn)錄因子T-bet、RORγt和標(biāo)志性細(xì)胞因子IFN-γ、IL-17的mRNA表達(dá);上調(diào)Th2、Treg主要轉(zhuǎn)錄因子Gata-3、Foxp3及Th2、Treg標(biāo)志性細(xì)胞因子IL-4、TGF-β mRNA的表達(dá)，表明NTAP對(duì)機(jī)體的輔助性T細(xì)胞亞群有一定的免疫調(diào)

12、節(jié)作用。
　　第三部分、非T細(xì)胞結(jié)合肽對(duì)膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜組織和脾臟T淋巴細(xì)胞凋亡的影響
　　目的:觀察NTAP對(duì)膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜組織和脾臟T淋巴細(xì)胞凋亡的影響，從凋亡途徑探討NTAP對(duì)CIA大鼠的作用及其機(jī)制。
　　方法:采用TUNEL法檢測(cè)滑膜細(xì)胞凋亡率，免疫組織化學(xué)法檢測(cè)Bcl-2和Bax在滑膜組織中的定位和表達(dá)，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)脾臟T淋巴細(xì)胞凋亡率。
　　結(jié)果:
　　1.TUNEL法檢測(cè)

13、滑膜細(xì)胞凋亡率結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠測(cè)滑膜細(xì)胞凋亡率明顯降低(P＜0.01）;與模型組比較，NTAP組大鼠滑膜細(xì)胞凋亡率明顯增加(P＜0.01)，無關(guān)肽組凋亡率明顯增加（P＜0.05）。
　　2.免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示，Bcl-2和Bax蛋白陽性染色呈棕黃色，主要在滑膜細(xì)胞胞漿表達(dá);對(duì)照組可見少量的Bcl-2和Bax蛋白陽性細(xì)胞;與對(duì)照組比較，模型組滑膜組織Bcl-2陽性細(xì)胞表達(dá)數(shù)目明顯增多(P＜0.01)，Bax陽性細(xì)

14、胞表達(dá)明顯減少(P＜0.05）;與模型組比較，NTAP組大鼠滑膜組織Bax陽性細(xì)胞數(shù)明顯增多，Bcl-2陽性細(xì)胞數(shù)明顯減少(P＜0.01)。
　　3..流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠脾臟CD3+淋巴細(xì)胞凋亡率明顯降低(P＜0.05）;與模型組比較，NTAP組脾臟CD3+淋巴細(xì)胞凋亡率明顯增加(P＜0.05)。
　　結(jié)論:NTAP可以明顯提高膠原性誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎大鼠的滑膜細(xì)胞凋亡率，減弱Bcl-2表達(dá)，增強(qiáng)Ba

15、x蛋白表達(dá)。NTAP對(duì)脾臟CD3+淋巴細(xì)胞的凋亡率亦有改善作用。
　　小結(jié):
　　1.NTAP可明顯降低關(guān)節(jié)炎指數(shù)，緩解大鼠足爪腫脹，改善滑膜病理，降低滑膜組織IL-17表達(dá)，表明NTAP對(duì)膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎大鼠具有一定的治療作用。
　　2.NTAP可以調(diào)節(jié)大鼠脾臟T細(xì)胞Th1、Th2、Th17及Treg四種亞型的比例，抑制CD4+T細(xì)胞向Th1和Th17細(xì)胞分化，促進(jìn)其向Th2和Treg細(xì)胞分化。下調(diào)Th1、Th17細(xì)胞

16、的主要轉(zhuǎn)錄因子T-bet、RORγt和標(biāo)志性細(xì)胞因子IFN-γ、IL-17的mRNA表達(dá);上調(diào)Th2、Treg主要轉(zhuǎn)錄因子Gata-3、Foxp3及Th2、Treg標(biāo)志性細(xì)胞因子IL-4、TGF-β的mRNA表達(dá)，表明NTAP對(duì)機(jī)體的輔助性T細(xì)胞亞群有一定的免疫調(diào)節(jié)作用。
　　3.NTAP可以明顯提高膠原性關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜細(xì)胞凋亡率，減弱Bcl-2表達(dá)，增強(qiáng)Bax蛋白表達(dá)。NTAP對(duì)脾臟CD3+淋巴細(xì)胞凋亡率亦有改善作用。