非T細胞結合肽對膠原誘導關節(jié)炎大鼠的治療作用及其機制研究.pdf

1、類風濕關節(jié)炎(RA）是一種常見的自身免疫性疾病。目前其病因仍不清楚，但深入研究表明T細胞在類風濕關節(jié)炎的發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用。膠原誘導性關節(jié)炎模型由于其引起的免疫機制和關節(jié)病理與類風濕關節(jié)炎相似，被廣泛地應用于RA機制研究及關節(jié)炎治療藥物的篩選。
　　變構肽在自身免疫疾病中的免疫調節(jié)作用研究已有一定基礎。Ⅱ型膠原(CⅡ)是涉及RA發(fā)病機制的重要的自身抗原。非T細胞結合肽(Non-T cellbinding peptide，NTA

2、P)是一種CⅡ263-272特定表位的變構肽，采用甘氨酸或丙氨酸替換了類風濕關節(jié)炎主要抗原的疾病相關肽段CⅡ263-272抗原肽上能夠與TCR結合的氨基酸，保留CⅡ263-272抗原肽上能與RA相關的MHCⅡ類分子結合的氨基酸。本研究采用膠原誘導性關節(jié)炎大鼠模型，觀察TAP對關節(jié)炎的治療作用，并且從輔助性T細胞亞群和相關細胞因子，以及凋亡等方面來探討NTAP的作用機制。
　　第一部分、非T細胞結合肽對膠原誘導關節(jié)炎大鼠的治療作用<

3、br>　　目的:觀察NTAP對膠原誘導關節(jié)炎大鼠的治療作用。
　　方法:選擇6-7周齡的Lewis雌性大鼠，隨機分為對照組和CIA模型組。CIA模型組大鼠于尾根部皮內注射牛Ⅱ型膠原與不完全弗氏佐劑配制的乳劑，7天后同法加強免疫1次。成模大鼠隨機分為模型組、NTAP組、原型肽組和無關肽組，模型組、NTAP組每組10只，原型肽組、無關肽組每組8只。尾靜脈注射給藥，給藥劑量分別為1mg/kg，1.07 mg/kg和1 mg/kg，隔天一

4、次，連續(xù)兩周。模型組和對照組以相同方法和體積注射PBS。給藥期間進行關節(jié)炎癥評分，給藥結束后144h處死大鼠，X光檢查大鼠后爪的跖骨變化，HE染色法觀察滑膜組織形態(tài)學變化，免疫組織化學法檢測IL-17在關節(jié)滑膜的的定位和表達。
　　結果:
　　1.與模型組比較，NTAP組關節(jié)炎評分明顯改善（P＜0.01）;X光檢查評分有差異。
　　2.HE染色結果顯示，對照組大鼠滑膜由1～2層扁平滑膜細胞及滑膜下層組成，無炎性細胞浸潤

5、及纖維增生。規(guī)整平滑，細胞間連接緊密，方向一致。與對照組大鼠滑膜相比，CIA大鼠滑膜內襯層細胞增殖，層數(shù)增多，細胞間隙增寬，排列紊亂，呈現(xiàn)典型的柵欄樣結構，襯里下層區(qū)域多種炎性細胞彌漫性浸潤，血管增生明顯，結締組織脂肪細胞增多。和模型組大鼠相比，NTAP組大鼠滑膜層數(shù)減少，排列趨于整齊，炎性細胞浸潤和滑膜增生減少。與對照組大鼠滑膜相比，模型組滑膜組織中IL-17表達明顯升高(P＜0.01）。與模型組比較，NTAP組IL-17表達明顯降低

6、(P＜0.01)，原型肽組和無關肽組亦明顯降低（P＜0.01）。
　　結論:NTAP可明顯改善關節(jié)炎指數(shù)，改善滑膜病理和跖骨損傷，降低滑膜組織IL-17表達，表明NTAP對膠原誘導關節(jié)炎大鼠具有一定的治療作用。
　　第二部分、非T細胞結合肽對膠原誘導關節(jié)炎大鼠輔助性T細胞亞群的影響
　　目的:觀察NTAP對膠原誘導關節(jié)炎大鼠輔助性T細胞亞群和相關細胞因子與轉錄因子的影響，并探討其作用機制。
　　方法:采用流式細胞

7、術測定脾臟中Th1、Th2、Th17和Treg的細胞水平。RT-PCR法測定脾臟中Th1、Th2、Th17、Treg相關的主要轉錄因子T-bet、Gata-3、RORγt及Foxp3 mRNA的表達，以及Th1、Th2、Th17、Treg標志性細胞因子IFN-γ、 IL-4、IL-17、TGF-β的mRNA表達。
　　結果:
　　1.與對照組比較，模型組Th1、Th17細胞比例及Th1/Th2細胞比值明顯升高，Th2、Tre

8、g細胞比例明顯降低(P＜0.01);與模型組比較，NTAP組Th1、Th17細胞比例及Th1/Th2細胞比值明顯降低，Treg細胞比例明顯升高(P＜0.01)，原型肽組Th2細胞明顯升高，Th17細胞明顯降低(P＜0.05)，無關肽組Th17細胞明顯降低(P＜0.01)。
　　2.與對照組比較，模型組大鼠脾臟中IFN-γ、IL-17、IL-4 mRNA表達明顯升高，TGF-β mRNA表達明顯降低(P＜0.01)。與模型組比較，N

9、TAP組大鼠脾臟中IFN-γ、IL-17 mRNA表達明顯降低(P＜0.01)，IL-4、TGF-βmRNA表達明顯升高(P＜0.05，P＜0.01);與模型組比較，原型肽組大鼠脾臟中IL-17 mRNA表達明顯降低(P＜0.01)，無關肽組大鼠脾臟中IL-17mRNA表達也明顯降低(P＜0.01)。
　　3.與對照組比較，模型組大鼠脾臟中T-bet、RORγt mRNA表達明顯升高，Gata-3、Foxp3 mRNA表達明顯降低

10、(P＜0.01)。與模型組比較，NTAP組大鼠脾臟中T-bet、RORγt mRNA表達明顯下調，Gata-3、Foxp3mRNA表達明顯上升(P＜0.01);原型肽組大鼠脾臟細胞中T-bet、Foxp3mRNA表達明顯降低(P＜0.01)，RORγt mRNA表達與模型組大鼠比較沒有差異，而Gata-3 mRNA表達明顯升高(P＜0.01);無關肽組大鼠脾臟中RORγt mRNA表達明顯下降(P＜0.01)。
　　結論:NTAP

11、可調節(jié)大鼠脾臟T細胞Th1、Th2、Th17及Treg四種亞型的比例，抑制CD4+T細胞向Th1和Th17細胞分化，促進其向Th2和Treg細胞分化。下調Th1、Th17細胞的主要轉錄因子T-bet、RORγt和標志性細胞因子IFN-γ、IL-17的mRNA表達;上調Th2、Treg主要轉錄因子Gata-3、Foxp3及Th2、Treg標志性細胞因子IL-4、TGF-β mRNA的表達，表明NTAP對機體的輔助性T細胞亞群有一定的免疫調

12、節(jié)作用。
　　第三部分、非T細胞結合肽對膠原誘導關節(jié)炎大鼠滑膜組織和脾臟T淋巴細胞凋亡的影響
　　目的:觀察NTAP對膠原誘導關節(jié)炎大鼠滑膜組織和脾臟T淋巴細胞凋亡的影響，從凋亡途徑探討NTAP對CIA大鼠的作用及其機制。
　　方法:采用TUNEL法檢測滑膜細胞凋亡率，免疫組織化學法檢測Bcl-2和Bax在滑膜組織中的定位和表達，采用流式細胞術檢測脾臟T淋巴細胞凋亡率。
　　結果:
　　1.TUNEL法檢測

13、滑膜細胞凋亡率結果顯示，與對照組比較，模型組大鼠測滑膜細胞凋亡率明顯降低(P＜0.01）;與模型組比較，NTAP組大鼠滑膜細胞凋亡率明顯增加(P＜0.01)，無關肽組凋亡率明顯增加（P＜0.05）。
　　2.免疫組化檢測結果顯示，Bcl-2和Bax蛋白陽性染色呈棕黃色，主要在滑膜細胞胞漿表達;對照組可見少量的Bcl-2和Bax蛋白陽性細胞;與對照組比較，模型組滑膜組織Bcl-2陽性細胞表達數(shù)目明顯增多(P＜0.01)，Bax陽性細

14、胞表達明顯減少(P＜0.05）;與模型組比較，NTAP組大鼠滑膜組織Bax陽性細胞數(shù)明顯增多，Bcl-2陽性細胞數(shù)明顯減少(P＜0.01)。
　　3..流式細胞術檢測結果顯示，與對照組比較，模型組大鼠脾臟CD3+淋巴細胞凋亡率明顯降低(P＜0.05）;與模型組比較，NTAP組脾臟CD3+淋巴細胞凋亡率明顯增加(P＜0.05)。
　　結論:NTAP可以明顯提高膠原性誘導性關節(jié)炎大鼠的滑膜細胞凋亡率，減弱Bcl-2表達，增強Ba

15、x蛋白表達。NTAP對脾臟CD3+淋巴細胞的凋亡率亦有改善作用。
　　小結:
　　1.NTAP可明顯降低關節(jié)炎指數(shù)，緩解大鼠足爪腫脹，改善滑膜病理，降低滑膜組織IL-17表達，表明NTAP對膠原誘導關節(jié)炎大鼠具有一定的治療作用。
　　2.NTAP可以調節(jié)大鼠脾臟T細胞Th1、Th2、Th17及Treg四種亞型的比例，抑制CD4+T細胞向Th1和Th17細胞分化，促進其向Th2和Treg細胞分化。下調Th1、Th17細胞

16、的主要轉錄因子T-bet、RORγt和標志性細胞因子IFN-γ、IL-17的mRNA表達;上調Th2、Treg主要轉錄因子Gata-3、Foxp3及Th2、Treg標志性細胞因子IL-4、TGF-β的mRNA表達，表明NTAP對機體的輔助性T細胞亞群有一定的免疫調節(jié)作用。
　　3.NTAP可以明顯提高膠原性關節(jié)炎大鼠滑膜細胞凋亡率，減弱Bcl-2表達，增強Bax蛋白表達。NTAP對脾臟CD3+淋巴細胞凋亡率亦有改善作用。