桂枝芍藥知母湯對(duì)Ⅱ型膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎大鼠作用機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究目的：類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoidarthritis，RA)是一種慢性進(jìn)行性的自身免疫性疾病，以關(guān)節(jié)滑膜炎及對(duì)稱(chēng)性、破壞性的關(guān)節(jié)病變?yōu)橹饕卣鳌A的發(fā)病率在我國(guó)約為0.4％全球?yàn)?.5％～1.0％。半個(gè)世紀(jì)以來(lái)，關(guān)于RA的發(fā)病機(jī)制一直處在不斷的發(fā)晨變化中。其中滑膜細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等產(chǎn)生的細(xì)胞因子和滑膜細(xì)胞的類(lèi)腫瘤樣增生在RA免疫炎癥和骨質(zhì)破壞中起著重要的作用，是研究熱點(diǎn)。中藥復(fù)方桂枝芍藥知母湯是金匱要略的名方，其方

2、祛風(fēng)除濕、溫經(jīng)散寒、滋陰清熱，臨床廣泛使用，治療類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎效果顯著，但其治療機(jī)制尚不清楚。Ⅱ型膠原誘導(dǎo)性大鼠關(guān)節(jié)炎模型(collagen-inducedarthritisCIA)模型在免疫病理、臨床表現(xiàn)、組織病理變化等方面與人RA最為接近，是目前國(guó)際公認(rèn)的研究RA發(fā)病機(jī)理、治療藥物的理想動(dòng)物模型。在本實(shí)驗(yàn)中，我們復(fù)制了Ⅱ型膠原誘導(dǎo)性大鼠關(guān)節(jié)炎模型，然后從桂枝芍藥知母湯對(duì)CIA大鼠的治療作用，血清細(xì)胞因子的影響，巨噬細(xì)胞功能的影響，對(duì)C

3、IA大鼠c-mycmRNA表達(dá)影響等方面對(duì)其機(jī)制進(jìn)行研究，為臨床用藥提供理論依據(jù)。 實(shí)驗(yàn)方法：本實(shí)驗(yàn)主要分為三個(gè)部分，以CIA大鼠作為動(dòng)物模型，探討桂枝芍藥知母湯治療RA的作用機(jī)制。 第一部分建立CIA大鼠模型。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為三組，即正常對(duì)照組，CIA模型組和佐劑對(duì)照組。其中CIA模型組以含Ⅱ型膠原的完全弗氏佐劑免疫，致炎后第14天發(fā)生繼發(fā)性腫脹，即右側(cè)足腫脹。觀察記錄大鼠的一般狀況，不同時(shí)間點(diǎn)各組大鼠繼發(fā)側(cè)關(guān)節(jié)的腫脹

4、度的變化，并繪制變化曲線。在免疫42天后，斷頭處死大鼠，取血清，用ELISA法測(cè)定CIA大鼠血清Ⅱ型膠原抗體的含量。 第二部分實(shí)驗(yàn)，Wistar大鼠CIA致敏第18天后，桂枝芍藥知母湯大、中劑量(37.2、18.6g/kg，分別相當(dāng)于成人每日常用量的20、10倍)，灌胃給藥。雷公藤多甙片研成細(xì)末，加生理鹽水，配成混濁液10g/kg.d，連續(xù)給藥3周。正常組、CIA模型組均灌以等容積蒸餾水。給藥三周后，大鼠斷頭處死。用Griess

5、法測(cè)定大鼠血清中NO的水平；用胸腺細(xì)胞法測(cè)定大鼠血清IL-1的含量。用ELISA法檢測(cè)TNF-α、IL-10含量的變化。用Griess法測(cè)定大鼠腹腔巨噬細(xì)胞NO產(chǎn)生能力；中性紅比色法測(cè)定巨噬細(xì)胞的吞噬功能，胸腺細(xì)胞法測(cè)定巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL-1的能力。用ELISA法檢測(cè)巨噬細(xì)胞分泌的TNF-α含量。通過(guò)以上指標(biāo)的測(cè)定，來(lái)探討桂枝芍藥知母湯對(duì)RA的治療機(jī)理。 第三部分實(shí)驗(yàn)用RT-PCR的方法檢測(cè)CIA大鼠滑膜細(xì)胞c-mycmRNA的表

6、達(dá)，從原癌基因的過(guò)度表達(dá)引起滑膜增生角度來(lái)探討桂枝芍藥知母湯對(duì)RA的治療作用。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：第一部分實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，致炎后14天大鼠開(kāi)始出現(xiàn)關(guān)節(jié)紅腫，首先出現(xiàn)紅腫的是右后足趾關(guān)節(jié)，然后蔓延到前足和尾部，并且日趨嚴(yán)重。關(guān)節(jié)腫脹于第21天達(dá)到高峰。發(fā)病過(guò)程伴隨大鼠體溫升高和體重減輕。隨著時(shí)間的延續(xù)腫脹逐漸消退，但最終可導(dǎo)致關(guān)節(jié)的畸形。免疫42天后，正常Wistar大鼠血清中含有抗CⅡ抗體，但模型組大鼠血清中CⅡ特異性抗體顯著高于正常對(duì)照組水

7、平(P＜0.01)。 第二部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，給藥2周后模型組與用藥組的足體積相比，有顯著差異(P＜0.01)；給藥3周后桂枝芍藥知母湯大劑量組與雷公藤多甙組的足體積相比，差異顯著(P＜0.01)；給藥2周后模型組與用藥組的關(guān)節(jié)炎指數(shù)相比，有顯著差異(P＜0.01)；給藥3周后桂枝芍藥知母湯與雷公藤多甙組的關(guān)節(jié)炎指數(shù)相比，差異顯著(P＜0.01)；桂枝芍藥知母湯大劑量組與桂枝芍藥知母湯中劑量組的關(guān)節(jié)炎指數(shù)相比，差異不顯著(P＞0.

8、05)。CIA大鼠血清中抗CⅡ抗體顯著高于正常組(P＜0.01)。與模型組相比，雷公藤治療后，大鼠血清中CⅡ抗體水平下降，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著(P＜0.05)；但是，桂枝芍藥知母湯治療后，CIA大鼠血清中抗CⅡ抗體較模型組變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。HE染色，觀察形態(tài)學(xué)改變。光鏡下正常組大鼠的關(guān)節(jié)滑膜組織由2～3層滑膜細(xì)胞及滑膜下層組成，滑膜細(xì)胞排列整齊，關(guān)節(jié)面光滑，關(guān)節(jié)腔內(nèi)無(wú)滲出。模型組大鼠的滑膜組織中有大量中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞，淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。出現(xiàn)大

9、量毛細(xì)血管?；ぜ?xì)胞增生，排列疏散、紊亂，滑膜細(xì)胞下纖維素大量滲出，膠原纖維沉著。經(jīng)桂枝芍藥知母湯治療后，滑膜炎癥狀減輕。模型組的CIA大鼠血清IL-1，TNF-α，NO的含量均明顯高于正常組(P＜0.01)；經(jīng)桂枝芍藥知母湯治療后，大劑量治療組的CIA大鼠血清IL-1，TNF-α，NO都低于模型組(P＜0.01或P＜0.05)；模型組CIA大鼠血清IL-10的濃度明顯低于正常組(P＜0.01)，經(jīng)桂枝芍藥知母湯治療后，血清IL-10的

10、濃度較模型組大鼠顯著升高(P＜0.01)。本實(shí)驗(yàn)中模型組的CIA大鼠腹腔巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的NO，IL-1，TNF-α均明顯高于正常組(P＜0.01)，桂枝芍藥知母湯治療后都有所下降(P＜0.01或P＜0.05)，桂枝芍藥知母湯大劑量組效果較好(P＜0.01)。模型組大鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬功能相比正常組功能下降(P＜0.01)，與模型組相比，雷公藤組大鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能有升高的趨勢(shì)，但沒(méi)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；桂枝芍藥知母湯大劑量治療組及中劑量組大鼠

11、腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能比模型組升高，同樣沒(méi)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 第三部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，正常對(duì)照組大鼠滑膜組織有較弱的c-mycmRNA的表達(dá)，而模型組CIA大鼠表達(dá)水平明顯增高。經(jīng)電泳條帶密度掃描，以β-actin為內(nèi)參對(duì)照，CIA大鼠滑膜組織c-mycmRNA表達(dá)顯著高于正常對(duì)照組(P＜0.01)，桂枝芍藥知母湯治療后，c-mycmRNA表達(dá)水平降低(P＜0.01)。 結(jié)論：實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，桂枝芍藥知母湯對(duì)CIA大鼠繼發(fā)側(cè)腫脹有很

12、好的改善，還可以明顯抑制CIA大鼠血清中炎性因子IL-1，TNF-α和小分子NO的產(chǎn)生以及促進(jìn)抑炎因子IL-10的產(chǎn)生。結(jié)果提示桂枝芍藥知母湯在RA中的治療作用可能與其對(duì)炎癥因子的抑制有關(guān)。同時(shí)，對(duì)CIA大鼠腹腔巨噬細(xì)胞分泌的IL-1，TNF-α，和小分子NO有明顯抑制作用。結(jié)果提示桂枝芍藥知母湯在RA中的治療作用可能與其抑制巨噬細(xì)胞分泌功能有關(guān)。通過(guò)對(duì)滑膜組織c-mycmRNA表達(dá)水平的測(cè)定，提示桂枝芍藥知母湯在RA中的治療作用可能與