雷公藤多苷對大鼠膠原誘導關節(jié)炎的時間治療學研究.pdf

1、目的：在觀察膠原誘導關節(jié)炎（collagen-induced arthritis，CIA）大鼠相關炎性細胞因子晝夜節(jié)律特點的基礎上，進一步觀察TG對CIA大鼠炎性因子晝夜節(jié)律的影響以及甲氨蝶呤（methotrexate，MTX）、來氟米特（leflunomide，LEF）、TG對CIA大鼠時間治療作用及其機制，為臨床的應用提供實驗室依據(jù)。
　　方法：
　　1實驗分組及處理
　　1.1第一部分：雌性Wistar大鼠80只

2、置于時間生物學實驗室，固定光照( L）∶黑暗（D）時間（L∶D=12∶12，明期為07:00～19:00，暗期為19:00～07:00）。將80只隨機分入空白組30只，模型組50只。適應飼養(yǎng)10天后建立CIA模型，觀察造模21d后，記錄成模大鼠踝關節(jié)和足爪腫脹度。第42d，分別于授時時間（zeitgeber time，ZT,以ZT0為光照開始）ZT2、ZT6、ZT10、ZT14、ZT18、ZT22，6個不同時間點分別平均處死大鼠，采血、

3、留取病變關節(jié)。
　　1.2第二部分：雌性Wistar大鼠120只置于時間生物學實驗室，固定光照（L）∶黑暗（D）時間（L∶D=12∶12，明期為07:00～19:00，暗期為19:00～07:00），自由攝食飲水。將60只大鼠按照大鼠藥物干預時間不同，分為授時時間TG-ZT6組與TG-ZT18組，每組60只。適應飼養(yǎng)10天后建立CIA模型，觀察造模21d后，選取成模CIA大鼠開始進行藥物干預，TG組灌胃（40mg/kg），每日給藥

4、。記錄大鼠踝關節(jié)和足爪腫脹度。藥物干預42d，分別于ZT2、ZT6、ZT10、ZT14、ZT18、ZT22，6個不同時間點分別平均處死大鼠，采血、留取病變關節(jié)。1.3第三部分：雌性Wistar大鼠120只置于時間生物學實驗室，固定光照（L）∶黑暗（D）時間（L∶D=12∶12，明期為07:00～19:00，暗期為19:00～07:00）。隨機將標記大鼠分入空白組8只，模型組16只，雷公藤多苷組（TG）32只，甲氨蝶呤組（MTX）32只，

5、來氟米特組（LEF）32只。適應飼養(yǎng)10d后建立CIA模型，觀察造模21d后，選取成模CIA大鼠開始進行藥物干預，MTX組灌胃（0.1mg/kg），TG組灌胃（40mg/kg），LEF組灌胃（2mg/kg），空白組與模型組均以等量3％羧甲基纖維素鈉灌胃。MTX隔日給藥，其余藥物均為1/日，持續(xù)給藥42d。記錄CIA模型大鼠踝關節(jié)和足爪腫脹度。干預結束后，采血、留取病變關節(jié)。
　　2實驗方法
　　2.1每3d使用游標卡尺法測量

6、大鼠踝關節(jié)直徑和足爪厚度。
　　2.2 ELISA方法檢測大鼠血清腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白介素-6（interleukin-6，IL-6）及白介素-17a（interleukin-17a，IL-17a）表達水平。
　　2.3免疫組織化學方法檢測病變關節(jié)滑膜細胞IL-6、IL-17a、基質金屬蛋白酶-3（matrix matallprotein-3，MMP-3）、TNF

7、-α、CLOCK及BMAL1表達水平；顯微鏡下觀察組織病理形態(tài)。
　　2.4藥物干預41d拍雙足爪X線正位片，觀察影像學進展。
　　2.5各組正態(tài)分布計量資料數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標準（x±s）差表示。組間差異采用多樣本均數(shù)的方差分析進行判斷，兩兩均數(shù)比較采用t檢驗進行判斷。檢驗水準α=0.05。
　　結果：
　　1 CIA大鼠相關炎性因子晝夜節(jié)律特點
　　1.1各組大鼠踝關節(jié)腫脹度變化
　　CIA大鼠隨著

8、造模時間的延長，關節(jié)腫脹度呈現(xiàn)先逐漸增加，后緩慢降低的趨勢。模型組CIA大鼠初次免疫33d時，踝關節(jié)腫脹最為嚴重；初次免疫39d時，掌指關節(jié)腫脹最為嚴重。
　　1.2CIA大鼠模型血清IL-17a、IL-6及TNF-α含量
　　各個時間點CIA大鼠模型血清IL-17a、IL-6及TNF-α含量各不相同?？瞻捉M大鼠一晝夜內IL-17a、IL-6及TNF-α血清水平穩(wěn)定；IL-17a、IL-6及TNF-α三種炎性因子在一晝夜內呈

9、現(xiàn)相近的波動特點：夜晚血清含量水平升高，白天血清水平降低。其中IL-17a在ZT18開始上升，并且于ZT22達到峰值；在ZT2開始下降，并且于ZT6達到谷值。IL-6在ZT14開始上升，并且于ZT22達到峰值；在ZT2開始下降，并且于ZT6進入平臺期。TNF-α在ZT14開始上升，并且于ZT22達到峰值；在ZT2開始下降，并且于ZT6進入谷值。
　　1.3各組CIA大鼠踝關節(jié)X線觀察
　　各組大鼠踝關節(jié)X線攝片結果差異較大。

10、其中空白組大鼠踝關節(jié)X線觀察踝關節(jié)關節(jié)面清晰，掌指關節(jié)骨皮質完整，關節(jié)間隙未見異常。模型組CIA大鼠踝關節(jié)關節(jié)面模糊，骨缺損明顯，掌指關節(jié)可見大塊骨缺損，關節(jié)間隙改變。
　　1.4各組CIA大鼠踝關節(jié)HE染色及免疫組織化學觀察
　　空白組大鼠踝關節(jié)HE染色可見滑膜平滑，1-2層滑膜細胞，無乳突狀突起或增生，未見多核細胞浸潤。模型組CIA大鼠踝關節(jié)HE染色可見滑膜細胞增生嚴重，乳突狀凸起，大量炎細胞浸潤。通過免疫組織化學檢測觀

11、察發(fā)現(xiàn)模型組大鼠滑膜細胞IL-17a、IL-6、TNF-α、MMP-3、CLOCK及BMAL1表達量均明顯高于空白組表達。
　　2雷公藤多苷對CIA大鼠相關炎性因子晝夜節(jié)律的影響
　　2.1各組CIA大鼠關節(jié)腫脹度值變化
　　干預42d各組CIA大鼠關節(jié)腫脹度變化各不相同，隨著造模時間的延長，CIA大鼠關節(jié)腫脹度逐漸增加。兩時間治療組相比較，觀察第42dTG-ZT18組踝關節(jié)直徑及足爪厚度腫脹抑制程度顯著優(yōu)于TG-ZT

12、6組（P＜0.05），在持續(xù)觀察時間內， TG-ZT18足爪厚度變化曲線始終位于TG-ZT6組曲線之下。
　　2.2各組CIA大鼠血清IL-17a、IL-6及TNF-α含量
　　干預42d各時間治療組CIA大鼠血清IL-17a、IL-6及TNF-α含量各不相同。與TG-ZT6組比較，TG-ZT18組血清IL-17a、IL-6及TNF-α含量明顯降低（P＜0.05）。
　　2.3各組CIA大鼠踝關節(jié)X線觀察
　　兩

13、組大鼠踝關節(jié)X線攝片結果有明顯不同。TG-ZT6組CIA大鼠踝關節(jié)關節(jié)破壞，關節(jié)面模糊，部分關節(jié)可見骨缺損。TG-ZT18組CIA大鼠踝關節(jié)關節(jié)面尚可見，左足改變較輕，少部分掌指關節(jié)骨破壞，關節(jié)間隙輕度改變。
　　2.4各組CIA大鼠踝關節(jié)HE染色及免疫組織化學觀察
　　TG-ZT6組CIA大鼠踝關節(jié)HE染色可見滑膜細胞增生，乳突狀凸起，大量炎細胞浸潤；TG-ZT18組CIA大鼠踝關節(jié)HE染色可見滑膜細胞增生較輕，乳突狀凸起

14、，少量炎細胞浸潤。免疫組織化學檢測觀察發(fā)現(xiàn)TG-ZT18組大鼠滑膜細胞IL-17a、IL-6、TNF-α、MMP-3、CLOCK及BMAL1表達量均明顯高于TG-ZT6組表達。
　　3 MTX、LEF和TG對CIA大鼠時間治療及其機制
　　3.1各組CIA大鼠踝關節(jié)腫脹度值變化
　　干預42d各組CIA大鼠關節(jié)腫脹度變化各不相同。與模型組相比較，MTX組、LEF組及TG組腫脹度均明顯下降（P＜0.05）；其中踝關節(jié)腫脹

15、度以MTX下降最為明顯，足爪厚度以LEF組下降最為明顯。干預第42dMTX-ZT18組腫脹度明顯低于MTX-ZT6組（P＜0.05），干預第21d之后MTX-ZT18組整體腫脹度曲線在MTX-ZT6之下；干預第42d，與TG-ZT6組相比較，TG-ZT18組腫脹度也顯著降低（P＜0.05），但是TG-ZT6組起效較慢，而TG-ZT18組變化趨勢整體在TG-ZT6組之下；干預第42d，LEF-ZT6組與LEF-ZT18組相比較，無顯著差異

16、（P＞0.05）。
　　3.2各組CIA大鼠血清IL-17a、IL-6及TNF-α含量
　　干預42d各時間治療組CIA大鼠血清IL-17a、IL-6及TNF-α含量各不相同。與模型組比較，兩MTX時間治療組血清IL-17a、IL-6及TNF-α含量均顯著下降（P＜0.05）；與MTX-ZT6比較，MTX-ZT18組血清IL-17a、IL-6及TNF-α含量明顯降低（P＜0.05）。與模型組比較，兩LEF時間治療組血清IL-

17、17a、IL-6及TNF-α含量均顯著下降（P＜0.05），與LEF-ZT6組相比較，LEF-ZT18組血清IL-17a、IL-6及TNF-α含量均無顯著差異（P＞0.05）。與模型組比較，TG-ZT18組血清IL-17a、IL-6及TNF-α含量明顯下降（P＜0.05），TG-ZT6組與模型組相比較血清IL-6與TNF-α含量明顯降低（P＜0.05），血清IL-17a水平卻與模型組比較無顯著差異（P＞0.05）；與TG-ZT6組比較，

18、TG-ZT18組血清IL-17a、IL-6及TNF-α含量明顯降低（P＜0.05）。
　　3.3各組大鼠踝關節(jié)X線攝片
　　各組大鼠踝關節(jié)X線攝片結果差異較大。其中正常組大鼠踝關節(jié)X線觀察踝關節(jié)關節(jié)面清晰，掌指關節(jié)骨皮質完整，關節(jié)間隙未見異常。模型組CIA踝關節(jié)關節(jié)面模糊，骨缺損明顯，掌指關節(jié)可見大塊骨缺損，關節(jié)間隙改變。MTX-ZT6組CIA大鼠踝關節(jié)關節(jié)破壞，關節(jié)面模糊，部分掌指關節(jié)可見骨缺損。MTX-ZT18組CIA大

19、鼠踝關節(jié)關節(jié)面尚可見，左足改變較輕，少部分掌指關節(jié)骨破壞，關節(jié)間隙輕度改變。LEF-ZT6組與LEF-ZT18組CIA大鼠踝關節(jié)關節(jié)面均可見，未見明顯骨破壞。TG-ZT6組CIA大鼠踝關節(jié)關節(jié)破壞，關節(jié)面模糊，部分關節(jié)可見骨缺損。TG-ZT18組CIA大鼠踝關節(jié)關節(jié)面尚可見，左足改變較輕，少部分掌指關節(jié)骨破壞，關節(jié)間隙輕度改變。
　　3.4各組CIA大鼠踝關節(jié)HE染色及免疫組織化學觀察
　　空白組大鼠踝關節(jié)HE染色可見滑膜平

20、滑，1-2層滑膜細胞，無乳突狀突起或增生，未見多核細胞浸潤。模型組CIA大鼠踝關節(jié)HE染色可見滑膜細胞增生嚴重，乳突狀凸起，大量炎細胞浸潤。TG組、LEF組和MTX組CIA大鼠踝關節(jié)HE染色可見滑膜細胞均有不同程度增生和炎細胞浸潤；同時TG-ZT18、LEF-ZT18、MTX-ZT18組分別與TG-ZT6、LEF-ZT6、MTX-ZT6比較滑膜細胞增生均較輕和炎細胞浸潤減少。免疫組織化學檢測大鼠踝關節(jié)觀察發(fā)現(xiàn)模型組大鼠滑膜細胞IL-17

21、a、IL-6、TNF-α、MMP-3、CLOCK及BMAL1表達水平均明顯高于空白組；TG組、LEF組和MTX組CIA大鼠踝關節(jié)滑膜細胞IL-17a、IL-6、TNF-α、MMP-3、CLOCK及BMAL1表達水平與模型組相比較明顯降低；同時TG-ZT18、LEF-ZT18、MTX-ZT18組分別與TG-ZT6、LEF-ZT6、MTX-ZT6比較滑膜細胞IL-17a、IL-6、TNF-α、MMP-3、CLOCK及BMAL1表達量均有不同