依達(dá)拉奉對(duì)大鼠膠原性關(guān)節(jié)炎的治療作用及其對(duì)滑膜細(xì)胞凋亡的影響.pdf

1、目的：類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種慢性進(jìn)行性自身免疫性疾病，以對(duì)稱性、侵蝕性關(guān)節(jié)滑膜炎為主要特征，病變呈持續(xù)性、反復(fù)發(fā)作過(guò)程。病情逐漸發(fā)展可引起多系統(tǒng)受累并最終導(dǎo)致骨和軟骨的破壞及關(guān)節(jié)功能障礙。RA的病因及發(fā)病機(jī)制至今尚未完全闡明，但是大量研究證實(shí)：多種免疫活性細(xì)胞的活化，細(xì)胞因子、炎癥介質(zhì)的共同參與，滑膜細(xì)胞增殖與凋亡的不平衡及血管翳的形成是造成疾病發(fā)生發(fā)展的重要原因。目前，對(duì)于RA的治療，國(guó)內(nèi)

2、外尚無(wú)理想藥物。傳統(tǒng)抗風(fēng)濕藥物毒副作用較大，療效差且療程長(zhǎng)，而生物制劑價(jià)格昂貴，還不能被普遍應(yīng)用。因此，尋找一種新的治療藥物或治療方法尤為重要。最新研究表明滑膜細(xì)胞的增殖凋亡不平衡在類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)生及發(fā)展過(guò)程中具有相當(dāng)重要的地位，并可能成為類(lèi)風(fēng)濕治療的新靶點(diǎn)。依達(dá)拉奉（edaravone）作為臨床上唯一一種自由基清除劑能有效清除自由基物質(zhì)，近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)其除了具有明確清除自由基的作用之外，還發(fā)揮著其它多方面效用，包括降低NF-κB活性和

3、調(diào)節(jié)凋亡等作用，有日本學(xué)者發(fā)現(xiàn)它能夠緩解RA患者的關(guān)節(jié)炎癥狀，但國(guó)內(nèi)尚無(wú)用其治療RA的報(bào)道。由Ⅱ型膠原所誘導(dǎo)的膠原性關(guān)節(jié)炎大鼠（collagen-induced arthritis，CIA）模型被認(rèn)為具有與RA相似的關(guān)節(jié)炎變化，本實(shí)驗(yàn)即以膠原性關(guān)節(jié)炎大鼠模型為基礎(chǔ)，從關(guān)節(jié)腫脹度、關(guān)節(jié)滑膜組織細(xì)胞凋亡情況及NF-κB、凋亡相關(guān)基因Fas、FasL在CIA大鼠關(guān)節(jié)滑膜中的表達(dá)水平幾個(gè)方面，觀察依達(dá)拉奉對(duì)CIA的影響，評(píng)價(jià)其療效，探討依達(dá)拉奉

4、與NF-κB、滑膜細(xì)胞凋亡及其相關(guān)基因Fas、FasL四者之間的相關(guān)性及依達(dá)拉奉治療RA的機(jī)制和臨床應(yīng)用價(jià)值。
　　 方法：（1）選用30只成年雄性Wistar大鼠，隨機(jī)分成5組，每組6只，分別命名為Ⅰ～Ⅴ組，其中Ⅰ組為正常對(duì)照組，Ⅱ組為模型對(duì)照組，Ⅲ組為依達(dá)拉奉低劑量組，Ⅳ組為依達(dá)拉奉高劑量組，Ⅴ組為氯諾昔康組。Ⅱ～Ⅴ組每只大鼠給予尾根部皮內(nèi)注射膠原（CFA）0.1ml制作CIA模型。（2）于造模致炎后第18天開(kāi)始Ⅲ～Ⅳ組分別

5、給予依達(dá)拉奉3.0mg/kg2/d、6.0.mg/kg2/d腹腔注射治療，Ⅴ組給予氯諾昔康4.0mg/kg1/d腹腔注射治療。（3）注射后連續(xù)觀察大鼠的一般情況及關(guān)節(jié)炎癥表現(xiàn)，用游標(biāo)卡尺測(cè)定不同時(shí)間點(diǎn)各組大鼠的右足墊厚度，并進(jìn)行關(guān)節(jié)炎指數(shù)（A1）評(píng)定。（4）各組大鼠于第28天采血處死后取大鼠雙膝關(guān)節(jié)滑膜組織，4％多聚甲醛固定，石蠟包埋，行蘇木素-伊紅（HE）染色，光鏡下觀察關(guān)節(jié)滑膜襯里層細(xì)胞（LCC）增生，襯里下層炎細(xì)胞浸潤(rùn)及血管翳形成

6、等病理變化。（5）對(duì)大鼠滑膜組織進(jìn)行流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)其細(xì)胞凋亡率及Fas，F(xiàn)asL表達(dá)水平。（6）NF-κB的SP免疫組織化學(xué)染色，采用真彩色病理圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行定量分析。（7）應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
　　 結(jié)果：（1）關(guān)節(jié)炎指數(shù)（AI）：第Ⅱ組大鼠造模后各時(shí)間點(diǎn)的AI均高于第Ⅰ組（P<0.01），造模后18天開(kāi)始比第15天顯著升高（P<0.01），但高峰出現(xiàn)在造模后21天；Ⅲ～Ⅴ組造模后18天開(kāi)始比第15天顯

7、著升高（P<0.05），高峰出現(xiàn)在造模后18天，Ⅲ～Ⅴ組間AI無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。（2）右足墊厚度：各組大鼠免疫后12天之內(nèi)右足墊厚度與第Ⅰ組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，Ⅱ～Ⅴ組于免疫后第15天右足墊厚度高于Ⅰ組（P<0.05）其中Ⅱ組于18、21天達(dá)到高峰，之后有所下降（P<0.01），Ⅲ～Ⅴ組高峰出現(xiàn)在18、21天，第21天開(kāi)始Ⅲ～Ⅴ組右足墊厚度開(kāi)始有所下降，21～27天Ⅲ～Ⅴ組右足墊厚度明顯低于Ⅱ組（P<0.05），但Ⅲ～Ⅴ三組之

8、間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。（3）滑膜組織細(xì)胞凋亡率：Ⅱ組大鼠造模后第28天滑膜組織細(xì)胞凋亡率與Ⅰ組（正常對(duì)照組）相比不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。Ⅲ～Ⅴ組大鼠造模后第28天滑膜組織細(xì)胞凋亡率明顯高于第Ⅰ組（P<0.01）及第Ⅱ組（P<0.01），但Ⅲ～Ⅴ三組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。（4）滑膜NF-κB的積分光密度（IOD）值：Ⅱ組大鼠顯著高于Ⅰ組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.01）；Ⅲ～Ⅴ組N-κB的IOD值在造模后28天明顯低于Ⅱ組，具

9、有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.01），但Ⅲ～Ⅴ組三者相比沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05），Ⅲ～Ⅴ組NF-κB的IOD值高于Ⅰ組并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。（5）滑膜組織Fas表達(dá)：Ⅱ組大鼠造模后第28天滑膜組織Fas表達(dá)高于Ⅰ組（正常對(duì)照組）（P<0.01）。Ⅲ～Ⅴ組大鼠造模后第28天滑膜組織Fas表達(dá)高于Ⅰ組（P<0.01）及Ⅱ組（P<0.05），但Ⅲ～Ⅴ三組之間滑膜組織Fas表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。（6）滑膜組織FasL表達(dá)：

10、Ⅱ組大鼠造模后第28天滑膜組織FasL表達(dá)低于Ⅰ組（正常對(duì)照組）并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。Ⅲ～Ⅴ組大鼠造模后第28天滑膜組織FasL表達(dá)均高于Ⅰ組（P<0.01）及Ⅱ組（P<0.01），但Ⅲ～Ⅴ三組之間滑膜組織FasL表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。（7）相關(guān)性分析：AI與右足墊厚度之間呈直線正相關(guān)；滑膜細(xì)胞凋亡率與AI之間呈負(fù)相關(guān)，滑膜組織FasL表達(dá)與凋亡率呈正相關(guān)；滑膜組織NF-κB的IOD值與右足墊厚度及AI值呈直線正

11、相關(guān)，且三者之間分別呈正相關(guān)。
　　 結(jié)論：（1）依達(dá)拉奉對(duì)CIA大鼠有明顯的抗炎作用，能夠降低CIA大鼠的關(guān)節(jié)炎指數(shù)，減輕右足墊厚度。（2）依達(dá)拉奉能減輕滑膜組織腫脹，減少膝關(guān)節(jié)滑膜襯里層的增生，提示依達(dá)拉奉可能能延緩CIA大鼠病程進(jìn)展。（3）依達(dá)拉奉高劑量組對(duì)CIA大鼠的治療作用不高于低劑量組，提示依達(dá)拉奉的治療效果劑量依賴性不明顯。（4）依達(dá)拉奉能明顯增加CIA大鼠滑膜組織凋亡細(xì)胞數(shù)，并上調(diào)滑膜組織中Fas、FasL的表達(dá)