臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)重度燒傷大鼠腎臟及肺保護(hù)作用的研究.pdf

1、嚴(yán)重?zé)齻稍斐扇矶嗯K器損傷和功能下降,特別是燒傷合并多器官功能障礙綜合征,是導(dǎo)致病人死亡的主要原因。雖然燒傷后各器官結(jié)構(gòu)和功能損傷的確切機(jī)制仍然不完全明了,但諸多研究表明,燒傷后局部微環(huán)境改變與組織器官修復(fù)和再生關(guān)系密切;特別是缺血、缺氧及炎性介質(zhì)大量釋放和氧自由基產(chǎn)生是導(dǎo)致多器官功能衰竭的重要原因。目前已有研究表明在受損后應(yīng)用間充質(zhì)干細(xì)胞可以有效改善損傷局部微環(huán)境,從而促進(jìn)細(xì)胞活性以及修復(fù)損傷組織。間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchyma

2、l stem cells,MSCs)是具有增殖和多向分化潛能的一類多能干細(xì)胞,可從胎兒血液、肝臟、骨髓、脂肪等多種組織獲得,是一群多潛能細(xì)胞,可以向多種組織如骨、軟骨、肌肉、韌帶、肌腱、脂肪及基質(zhì)細(xì)胞增殖分化。臨床上利用MSCs移植治療某些疾病也已取得較好效果。
　　目前,在針對(duì)組織再生與修復(fù)的各項(xiàng)研究中,自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow derived-MSCs,BMMSCs)的研究和應(yīng)用最為廣泛,在體修復(fù)損傷組織的

3、技術(shù)方法已經(jīng)建立及得到應(yīng)用。然而,骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的獲取須行骨髓穿刺術(shù),給供者造成一定痛苦,且骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖及分化潛能隨供者年齡的增大而下降。而且以往對(duì)MSCs的應(yīng)用在損傷組織再生修復(fù)研究中僅限于后期的治療,在急性燒傷等需早期治療中往往受到細(xì)胞培養(yǎng)周期的限制而無法及時(shí)使用。因此尋找新的MSC來源成為國(guó)內(nèi)外干細(xì)胞研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。目前,臍帶來源間充質(zhì)干細(xì)胞(umbilical cord derived-MSCs,UCMSCs)的多向

4、分化潛能已得到證實(shí),而且具有來源廣泛、免疫反應(yīng)低、分化潛能大等多種優(yōu)勢(shì),因此,可以將UCMSCs作為一種嶄新的細(xì)胞治療策略應(yīng)用于燒傷后器官損傷修復(fù)再生研究。
　　嚴(yán)重?zé)齻鶎?dǎo)致的不同臟器損傷的發(fā)生與發(fā)展與嚴(yán)重程度也不盡相同,其中腎臟組織損傷是較早出現(xiàn)的并發(fā)癥。腎臟組織損傷的發(fā)生與多種細(xì)胞因子、嘌呤池耗竭、自由基的生成增多和清除能力減弱、能量代謝障礙、細(xì)胞凋亡和壞死等多種因素的作用有關(guān)。近期研究表明MSCs能夠參與炎癥組織的細(xì)胞遷移

5、,并通過產(chǎn)生多種再生因子,引起組織及浸潤(rùn)在黏膜內(nèi)活化的巨噬細(xì)胞失活,并通過促進(jìn)宿主自身細(xì)胞增殖修復(fù)損傷組織。這也提示UCMSCs可能對(duì)早期重度燒傷動(dòng)物具有較好的保護(hù)效應(yīng)。為探討UCMSCs在嚴(yán)重創(chuàng)傷后具體器官或組織中的具體作用以及其機(jī)制,本研究采用重度燒傷大鼠模型,觀察UCMSCs對(duì)傷后腎臟可能產(chǎn)生的作用,為UCMSCs應(yīng)用于燒傷后腎臟損傷的保護(hù)及機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。另外,燒傷后的急性肺損傷是傷后導(dǎo)致的急性進(jìn)行性缺氧性呼吸功能不全,也是導(dǎo)

6、致患者死亡的主要原因。但由于肺部結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性和易感染性,目前干細(xì)胞用于治療肺部疾病的研究落后于其他器官。已有文獻(xiàn)證實(shí)腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)等炎性介質(zhì)的合成釋放,中性粒細(xì)胞等在肺內(nèi)積聚,補(bǔ)體激活,氧自由基產(chǎn)生等所導(dǎo)致的一系列病理改變?cè)谄浒l(fā)病機(jī)制中起重要作用?；诖?本研究采用燒傷與細(xì)菌感染的雙重模型,試圖探討UCMSCs對(duì)創(chuàng)傷后急性肺損傷的保護(hù)效應(yīng)及可能機(jī)制。本研究結(jié)果有望為干細(xì)胞應(yīng)

7、用于燒傷后臟器的損傷保護(hù)及其機(jī)制研究奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　本實(shí)驗(yàn)主要由以下三部分內(nèi)容組成:
　　一、分離培養(yǎng)獲取UCMSCs及對(duì)其細(xì)胞生物學(xué)特性實(shí)驗(yàn)研究。在本實(shí)驗(yàn)中,采用膠原酶消化與組織貼壁相結(jié)合的方法,分離獲取臍帶沃頓膠(Wharton’s Jelly)來源的間充質(zhì)干細(xì)胞,采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞的表面抗原的表達(dá)、分析細(xì)胞的增殖活性;同時(shí)采用細(xì)胞化學(xué)法鑒定細(xì)胞的多向分化潛能(脂肪、骨及軟骨細(xì)胞)。結(jié)論:臍帶沃頓膠(Wharto

8、n’Jelly)中分離、提取的UCMSCs陽(yáng)性表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)記物抗原(CD29、CD44、CD90、CD105),陰性表達(dá)造血細(xì)胞系標(biāo)記物CD34。UCMSCs能夠分化為堿性磷酸酶染色陽(yáng)性的骨細(xì)胞、II型膠原抗體染色陽(yáng)性的軟骨細(xì)胞以及油紅-O染色陽(yáng)性的脂肪細(xì)胞。經(jīng)四甲基偶氮唑鹽(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)檢測(cè)法發(fā)現(xiàn),UCMSCs具有較強(qiáng)的細(xì)胞增殖能力。
　　二、UCMSCs對(duì)重度燒傷大鼠

9、腎臟保護(hù)作用的研究。
　　在本實(shí)驗(yàn)中,取已獲取并鑒定的P3-P7代UCMSCs靜脈注射20％總體表面積(total body surface area,TBSA)III度燒傷大鼠模型:其中以烏斯他汀治療為陽(yáng)性對(duì)照組、注射等量體積的生理鹽水組為陰性對(duì)照組。燒傷后大鼠模型愈合后,用冰凍切片法與免疫組織化學(xué)染色法在熒光顯微鏡下觀察UCMSCs在大鼠腎臟中分布特征,生化試驗(yàn)檢測(cè)其修復(fù)治療的治療效果。結(jié)論:經(jīng)與陽(yáng)性對(duì)照組、陰性對(duì)照組比較后發(fā)

10、現(xiàn),燒傷后7、14d的組織病理學(xué)觀察顯示,干細(xì)胞移植后的大鼠燒傷后腎臟組織充血、腫脹等病理學(xué)改變較烏司他丁組及生理鹽水組有所減輕,隨時(shí)間延長(zhǎng)減輕更加明顯;免疫組化觀察顯示UCMSCs組傷后7d和14d腎組織中Bcl-2的表達(dá)較烏司他丁組和生理鹽水組明顯增多,表明腎組織抗凋亡能力增強(qiáng)。大鼠燒傷后血尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)和肌酐(creatinine,Cr)均較正常對(duì)照組顯著升高。烏司他丁治療組7d和14dB

11、UN和Cr較生理鹽水組均明顯下降。UCMSCs組傷后7d和14dBUN和Cr均明顯下降,與生理鹽水組和烏司他丁組比較差異均有顯著性(P<0.05),顯示干細(xì)胞治療對(duì)腎功能有明顯改善作用。UCMSCs移植可有效減輕重度燒傷后大鼠腎臟組織的損傷并改善腎臟功能。
　　三、UCMSCs對(duì)創(chuàng)傷后早期急性肺損傷作用的研究
　　在本實(shí)驗(yàn)中取已獲取并鑒定的P3-P7代UCMSCs靜脈注射20%TBSAIII度燒傷大鼠模型(注射大腸桿菌內(nèi)毒素

12、):其中以烏斯他汀治療為陽(yáng)性對(duì)照組、注射等量體積的生理鹽水組為陰性對(duì)照組、注射UCMSCs為實(shí)驗(yàn)組。采用冰凍切片法與免疫組織化學(xué)染色法在熒光顯微鏡下觀察UCMSCs在大鼠肺中分布特征,生化試驗(yàn)檢測(cè)其修復(fù)治療的治療效果。結(jié)論:經(jīng)與陽(yáng)性對(duì)照組、陰性對(duì)照組比較后發(fā)現(xiàn),燒傷后7、14d的組織病理學(xué)觀察顯示,臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞能改善創(chuàng)傷性急性肺損傷動(dòng)物的血?dú)?不同程度降低外周血TNF-α及支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavag