刺頭復(fù)葉耳蕨總黃酮對(duì)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　研究刺頭復(fù)葉耳蕨總黃酮（total flavonoids from arachniodes exilis，TFAE)在人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUCMSCs）成骨分化中的作用，并進(jìn)一步研究雌激素受體（estrogen receptor，ER）信號(hào)途徑在其中的作用。
　　方法：
　　(1)采用組織塊貼壁法分離、培養(yǎng)hUCMSC

2、s，倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形3 hUCMSCs
　　(2)TFAE對(duì)hUCMSCs活性的影響：實(shí)驗(yàn)分為5組：0μg/mLTFAE組(對(duì)照組)，1μg/mLTFAE組，5μg/mLTFAE組，10μg/mLTFAE組，20μg/mLTFAE組，分別作用24h、48h、72h后，CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活性。
　　(3)TFAE對(duì)hUCMSCs成骨分化的影響：根據(jù)細(xì)胞活性檢測(cè)結(jié)果，實(shí)驗(yàn)分為4組：對(duì)照組（常規(guī)培養(yǎng)基），0μg/mLTF

3、AE組（0μg/mLTFAE的成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基），1μg/mLTFAE組（1μg/mLTFAE的成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基），5μg/mLTFAE組（5μg/mLTFAE的成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基），誘導(dǎo)培養(yǎng)3d、7d后，AMP法測(cè)定ALP活力；誘導(dǎo)培養(yǎng)14d后，茜素紅染色檢測(cè)鈣結(jié)節(jié)，RT-PCR檢測(cè)成骨相關(guān)基因Ⅰ型膠原a1(collagen type I alpha1, Col1a1)、骨橋蛋白(osteopotin, OPN)、Runx2、Osterix（

4、Osx）mRNA表達(dá)水平。
　　(4)ER在hUCMSCs成骨分化中的作用：實(shí)驗(yàn)分為4組：對(duì)照組（0μg/mLTFAE的成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基），TFAE組（5μg/mLTFAE的成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基），TFAE+S組（5μg/mLTFAE的成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基+S1191），S組(S1191），誘導(dǎo)培養(yǎng)3d、7d后，AMP法測(cè)定ALP活力；誘導(dǎo)培養(yǎng)14d后，茜素紅染色檢測(cè)鈣結(jié)節(jié)，RT-PCR檢測(cè)成骨相關(guān)基因Col1a1、OPN、Runx2、Osxm

5、RNA表達(dá)水平。
　　結(jié)果：
　　(1)臍帶組織貼壁培養(yǎng)3-5d后，培養(yǎng)皿中有細(xì)胞長(zhǎng)出，培養(yǎng)10-14d，組織塊周?chē)L(zhǎng)滿成纖維樣細(xì)胞，經(jīng)傳代培養(yǎng)后，細(xì)胞形態(tài)均一，貼壁良好。
　?。?）細(xì)胞活性檢測(cè)結(jié)果：CCK-8檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，1μg/mLTFAE組、5μg/mLTFAE組細(xì)胞活性明顯增強(qiáng)（P＜0.05或P＜0.01），10μg/mLTFAE組、20μg/mLTFAE組細(xì)胞活性明顯減弱（P＜0.05或P＜0

6、.01）。
　?。?）hUCMSCs成骨分化檢測(cè)結(jié)果：1）ALP檢測(cè)結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，0μg/mLTFAE、1μg/mLTFAE組及5μg/mLTFAE組細(xì)胞ALP活力明顯增強(qiáng)（P＜0.05或P＜0.01），與0μg/mLTFAE組，1μg/mLTFAE組及5μg/mLTFAE組細(xì)胞ALP活力也明顯增強(qiáng)（P＜0.05或P＜0.01）；2）茜素紅染色結(jié)果顯示：不同濃度TFAE組均有鈣結(jié)節(jié)形成，而對(duì)照組未見(jiàn)鈣結(jié)節(jié)，與0μg/mL

7、TFAE組相比，1μg/mLTFAE組及5μg/mLTFAE組鈣結(jié)節(jié)數(shù)量明顯增多（P＜0.01）；3）RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，0μg/mLTFAE組、1μg/mLTFAE組及5μg/mLTFAE組成骨相關(guān)基因 Col1a1、OPN、Runx2、OsxmRNA表達(dá)量明顯增加（ P＜0.01），與0μg/mLTFAE組相比，1μg/mLLTFAE組及5μg/mLTFAE組Col1a1、OPN、Runx2、OsxmRNA表達(dá)量

8、也明顯增加（P＜0.05或P＜0.01）。
　　（4）ER抑制劑作用下，hUCMSCs成骨分化檢測(cè)結(jié)果：
　　1）ALP檢測(cè)結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，TFAE組細(xì)胞ALP活力明顯增強(qiáng)（P＜0.01），與TFAE組相比，TFAE+S組細(xì)胞ALP活力明顯減弱（P＜0.05或P＜0.01），對(duì)照組與S組無(wú)差異；
　　2）茜素紅染色結(jié)果顯示：各組均有鈣結(jié)節(jié)形成，與對(duì)照組相比，TFAE組鈣結(jié)節(jié)數(shù)量增多（P＜0.01），而與TFAE

9、組相比，TFAE+S組鈣結(jié)節(jié)數(shù)量明顯減少（P＜0.01），對(duì)照組與S組無(wú)差異；
　　3）RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，TFAE組成骨相關(guān)基因Col1a1、OPN、Runx2、OsxmRNA表達(dá)量明顯增加（P＜0.01），與TFAE組相比，TFAE+S組Col1a1、OPN、Runx2、OsxmRNA表達(dá)量明顯減少（P＜0.05或P＜0.01），對(duì)照組與S組無(wú)差異。
　　結(jié)論：
　?。?）一定濃度的TFAE增強(qiáng)