骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用及其對(duì)GVHD影響的機(jī)制探討.pdf

1、移植物抗宿主病(gragt-vcrsus-host disease,GVHD)是異基因造血干細(xì)胞移植的主要并發(fā)癥。供者T淋巴細(xì)胞識(shí)別宿主抗原提呈細(xì)胞攜帶異基因抗原片斷，進(jìn)一步活化并且分泌大量細(xì)胞因子，從而造成宿主的組織損傷。雖然許多標(biāo)準(zhǔn)的GVHD預(yù)防方案已經(jīng)廣泛應(yīng)用于異基因造血干細(xì)胞移植術(shù)后，但重度的GVHD，尤其是激素難治型GVHD仍然嚴(yán)重威脅患者的生命。 aGVHD發(fā)生中的效應(yīng)階段包括體液免疫和細(xì)胞免疫兩方面，即活化的T淋

2、巴細(xì)胞釋放大量的炎癥因子，如TNF-α、IL-1等，同時(shí)自然殺傷細(xì)胞和細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞毒作用，兩者共同作用造成了宿主的組織損傷。I型T淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子如IL-2，IFNγ,這些炎癥因子促使單核巨噬細(xì)胞活化，對(duì)炎癥的形成起重要的作用，這些作用可以被Ⅱ型T細(xì)胞所分泌的免疫負(fù)調(diào)節(jié)細(xì)胞因子IL-4和IL-10所抑制。aGVHD的發(fā)生主要是以I型T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)，減少Ⅰ型T細(xì)胞的產(chǎn)生，增加Ⅱ型T細(xì)胞的比例，可以減低GV

3、HD所導(dǎo)致的移植相關(guān)死亡率。活化的T淋巴細(xì)胞的遷移在GVHD發(fā)病機(jī)制中起了至關(guān)重要的作用，這依賴于趨化因子和趨化因子受體之間的相互作用。CXCR3特異性地表達(dá)于Thl細(xì)胞表面，它的表達(dá)增高常出現(xiàn)于aGVHD的早期，并在GVHD發(fā)生過(guò)程中促使T細(xì)胞到達(dá)炎癥部位，進(jìn)而造成炎性損傷。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是骨髓造血微環(huán)境的重要組成成分，在體外適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件下，具有向成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)

4、胞、肌細(xì)胞、肌腱細(xì)胞等中胚層組織分化的能力。此外，MSCs最引人注目的特點(diǎn)是具有免疫逃逸和免疫負(fù)調(diào)節(jié)作用。體外實(shí)驗(yàn)中，MSCs可以抑制由同種異體抗原及有絲分裂原所誘導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞增殖的作用。器官移植時(shí)共輸注MSCs可減輕排斥反應(yīng)和延長(zhǎng)移植物生存時(shí)間。造血干細(xì)胞移植中輸注MSCs可以預(yù)防和治療GVHD。父代—子代半相合骨髓移植作為人類aGVHD動(dòng)物模型，已經(jīng)被廣泛運(yùn)用于研究GVHD發(fā)生過(guò)程中的免疫學(xué)改變。它為人們提供了GVHD中相關(guān)的T、

5、B淋巴細(xì)胞效應(yīng)機(jī)制的重要信息。 本研究對(duì)MSCs在GVHD的治療前景進(jìn)行了一些探索性研究。我們?cè)O(shè)計(jì)體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)兩個(gè)部分觀察MSCs的免疫調(diào)節(jié)作用。通過(guò)觀察MSCs對(duì)由異基因樹(shù)突狀細(xì)胞及植物血凝素誘導(dǎo)的CD2<'+>T淋巴細(xì)胞增殖作用的影響，以及MSCs與T淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)后，T細(xì)胞亞群比例的變化，了解MSCs的免疫調(diào)節(jié)作用及其可能的機(jī)制。進(jìn)一步建立父代一子代半相合小鼠骨髓移植模型，從體內(nèi)的角度研究小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)半相合骨

6、髓移植后aGVHD的作用，同時(shí)檢測(cè)小鼠外周血T細(xì)胞亞群比例的變化以及各個(gè)靶器官中趨化因子受體CXCR3的表達(dá)情況，從而進(jìn)一步探討其免疫調(diào)節(jié)作用的可能機(jī)制，為GVHD的有效防治提供理論依據(jù)。 方法 1．從人骨髓液中分離培養(yǎng)MSCs，從人臍血中分離培養(yǎng)樹(shù)突狀細(xì)胞(dendritic cells，DCs)，分別將DCs和植物血凝素(PHA)作為刺激因素，經(jīng)磁珠分選的人CD2<'+>T淋巴細(xì)胞作為反應(yīng)細(xì)胞，用<'3>H-TdR標(biāo)

7、記β液體閃爍計(jì)數(shù)儀檢測(cè)與MSCs共培養(yǎng)前后T淋巴細(xì)胞增殖能力的變化。 2．用流式細(xì)胞儀檢測(cè)與MSCs共培養(yǎng)10d后的CD2<'+>T細(xì)胞內(nèi)各亞群Thl、Th2、Tcl、Tc2比例的變化。 3．以親代C57BL/6(H-2b♂)d,鼠為供鼠，Balb/cxC57BL/6 FI(CB6F1)為受鼠，將來(lái)源于供鼠的1×10<'6>個(gè)脾細(xì)胞、l×l0<'5>個(gè)骨髓細(xì)胞經(jīng)鼠尾靜脈輸注入7.5 Gy<'60>Coγ射線全身照射后的

8、受鼠體內(nèi)，進(jìn)行半相合骨髓移植，建立aGVHD模型。同時(shí)，MSCs干預(yù)組中同時(shí)再輸入體外培養(yǎng)的C57BL/6(H-2b♂)小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞2x×lO<'5>個(gè)。 4．流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)供鼠(H2<'b>)及受鼠(H2b<,b×d>)陽(yáng)性細(xì)胞的比例，分析移植后6周內(nèi)嵌合率的變化，鑒定骨髓移植是否成功。通過(guò)生存期、臨床表現(xiàn)、組織病理學(xué)分析移植后各組小鼠aGVHD發(fā)生的情況。 5．在移植后6周內(nèi)，運(yùn)用流式細(xì)胞儀觀察小鼠外周血T

9、細(xì)胞亞群的變化，免疫組織化學(xué)觀察小鼠肝、脾、小腸、皮膚等器官中炎性細(xì)胞表面趨化因子受體CXCR3的變化。 結(jié)果 1．hMSCs能明顯抑制由DCs誘導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞增殖(P=0.004)，同時(shí)MSCs可抑制由PHA引起的T細(xì)胞增殖，但不具有顯著性差異(P=0.26)，MSCs培養(yǎng)上清液?jiǎn)为?dú)并不具備抑制T細(xì)胞增殖的作用。 2．與hMSCs共培養(yǎng)后的CD2<'+>T淋巴細(xì)胞中，Th2及Tc2亞群比例較共培養(yǎng)前明顯增加(P

10、<0.05)。 3．照射組、BM組及BM聯(lián)合MSCs輸注組小鼠的20周生存率分別為7.1％、45.5％、50％；組織病理學(xué)評(píng)分及GVHD臨床積分均顯示BM聯(lián)合MSCs輸注組小鼠的GVHD發(fā)生的程度較BM組明顯減輕(P<0.01)。 4．移植后6周內(nèi)，各組小鼠體內(nèi)T細(xì)胞亞群比例均有變化，其中Th2及Tc2亞群比例于MSCs組小鼠較BM組有所增加，成組t檢驗(yàn)示P<0.05；MSCs組小鼠肝臟、脾臟等組織內(nèi)CXCR3的表達(dá)較B

11、M組有所下調(diào)。 結(jié)論 1．MSCs對(duì)由樹(shù)突狀細(xì)胞和PHA誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)均具有抑制作用，并且這種作用可能與細(xì)胞間相互作用及誘導(dǎo)T細(xì)胞亞群向Ⅱ型T細(xì)胞極化有關(guān)。 2．輸注父代MSCs并不能明顯改善半相合骨髓移植小鼠生存率，但可減輕由aGVHD造成的靶器官損傷。 3．半相合骨髓移植后，輸注父代MSCs可增加小鼠外周血Ⅱ型T細(xì)胞亞群的比例，同時(shí)下調(diào)靶器官內(nèi)CXCR3+細(xì)胞數(shù)目。提示小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞輸注