人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的外泌體免疫調(diào)節(jié)功能異質(zhì)性的研究.pdf

1、間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells，MSC)對(duì)適應(yīng)性免疫和獲得性免疫均有一定的調(diào)節(jié)功能，成功運(yùn)用于治療移植物抗宿主病(Graft-Versus-Host Disease，GVHD)后迅速被臨床上用于治療其他免疫相關(guān)疾病。既往對(duì)MSC的作用機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，其功能受到細(xì)胞的來(lái)源，體外培養(yǎng)條件，輸入體內(nèi)后的微環(huán)境等多方面因素的影響。大量的臨床實(shí)驗(yàn)證明MSC在臨床上治療GVHD的療效具有很大差異。通過(guò)靜脈輸入體內(nèi)后的MSC

2、很難繼續(xù)存活，而主要依靠其旁分泌作用發(fā)揮功能，其中外泌體是重要的作用介質(zhì)?，F(xiàn)已有實(shí)驗(yàn)證實(shí)了外泌體參與MSC的免疫調(diào)節(jié)過(guò)程。但外泌體體積較小，直徑只有30nm～100nm，現(xiàn)有的提取方法尚不能快速，高效的制備外泌體。MSC的療效差異是否跟外泌體免疫調(diào)節(jié)能力有差異有關(guān)，尚缺乏相關(guān)的研究。本研究通過(guò)以下實(shí)驗(yàn)，對(duì)該問(wèn)題進(jìn)行探索。
　　選擇空軍總醫(yī)院2015-01至2015-05健康產(chǎn)婦的臍帶所提取的臍帶MSC細(xì)胞(Human umbili

3、cal cord-MSCs，hUC-MSCs)，擴(kuò)增代數(shù)為P3-P5。將MSC細(xì)胞分為5組，分別使用終濃度為2％、4％、6％、8％、10％的聚乙二醇6000(Polyethylene glycol6000，PEG6000)提取無(wú)血清MSC培養(yǎng)上清中的外泌體(hUC-MSCs-ex)，利用透射電子顯微鏡及流式細(xì)胞術(shù)對(duì)所得的物質(zhì)進(jìn)行鑒定，比較各組蛋白質(zhì)的含量。從入組的MSC中隨機(jī)選取5株不同供者來(lái)源的hUC-MSCs，收集無(wú)血清培養(yǎng)上清用P

4、EG6000提取外泌體。分離健康供者肝素抗凝臍帶血中的單個(gè)核細(xì)胞(Umbilicalcord blood mononuclear cells,UBMCs)。根據(jù)hUC-MSCs-ex來(lái)源不同分5大組(A、B、C、D、E)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，每組分為5小組進(jìn)行組間對(duì)比研究，進(jìn)一步觀察UBMCs增殖、分泌及對(duì)K562細(xì)胞殺傷作用的影響，分組為:陰性對(duì)照組，陽(yáng)性對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組1，實(shí)驗(yàn)組2，實(shí)驗(yàn)組3。均選用含血清的RPMI1640培養(yǎng)基，陰性對(duì)照組為空白

5、組;陽(yáng)性對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組1、2、3添加UBMCs激活物:刀豆蛋白A(Concanavalin A，ConA)、重組白介素2(rhIL-2);實(shí)驗(yàn)組1、2、3加入同一供者，不同濃度的(2μg/ml、5μg/ml、10μg/ml)hUC-MSCs-ex共培養(yǎng)。相同的分組將5株不同來(lái)源hUC-MSCs-ex和UBMCs共培養(yǎng)，觀察UBMCs增殖，分泌，對(duì)K562細(xì)胞殺傷作用的變化。
　　通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)使用PEG6000提取的外泌體在透射電子

6、顯微鏡下呈圓形，直徑在30nm～100nm左右，表達(dá)CD9，CD63，CD81及CD44，提示提取的物質(zhì)屬于MSC分泌的外泌體。用8％終濃度的PEG6000提取hUC-MSCs-ex的總蛋白的量最佳，為837±107μg/1×107cells。在抑制細(xì)胞增殖方面，外泌體的來(lái)源和濃度因素之間無(wú)交互作用(F=1.033，P＞0.05)。不同來(lái)源，不同濃度的hUC-MSCs-ex對(duì)UBMCs增殖抑制能力均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=77.362，P＜0

7、.01;F=13.862，P＜0.01)。其中C＃hUC-MSCs-ex各個(gè)濃度的抑制能力均高于其他實(shí)驗(yàn)組。在抑制細(xì)胞分泌IFN-γ，TNF-α方面，不同來(lái)源，不同濃度的hUC-MSCs-ex的抑制能力均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=63.390，P＜0.01;F=14.605，P＜0.01)。不同濃度的hUC-MSCs-ex抑制UBMCs分泌的能力有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，其中A＃hUC-MSCs-ex各個(gè)濃度的抑制能力均高于其他實(shí)驗(yàn)組。在抑制細(xì)胞殺傷能力方