衰老及IDO-1-COX-2基因修飾對臍帶間充質(zhì)干細胞免疫調(diào)節(jié)功能的影響.pdf

1、目的:
　　 研究臍帶間充質(zhì)干細胞(UC-MSCs)的衰老對其免疫調(diào)控能力的影響。并利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)使臍帶間充質(zhì)干細胞(UC-MSCs)過表達吲哚胺2，3雙加氧酶-1(IDO-1)或環(huán)加氧酶-2(COX-2)，研究其對MSCs免疫抑制功能的影響。
　　 方法:
　　 1.運用組織塊貼壁法從臍帶中獲得間充質(zhì)干細胞(MSCs)，并在常氧條件下進行傳代培養(yǎng)，通過細胞染色觀察傳代過程中MSCs形態(tài)及核質(zhì)比的變化。
　

2、　 2.分別選取第5代（對照組）及第13代（衰老組）MSCs進行研究，運用細胞衰老特異性β-半乳糖苷酶檢測試劑盒進行衰老檢測。對照組及衰老組MSCs分別與外周血單個核細胞(PBMC)共培養(yǎng)，同時采用CCK-8細胞計數(shù)試劑盒檢測MSCs對淋巴細胞增殖能力的影響。
　　 3.通過實時定量PCR方法檢測免疫調(diào)控相關(guān)基因在對照組與衰老組MSCs中的表達情況。
　　 4.分別構(gòu)建含靶基因IDO-1、COX-2的真核表達重組質(zhì)粒p

3、EGFP-N3/IDO-1及pEGFP-N3/COX-2，運用電轉(zhuǎn)染方法將其轉(zhuǎn)染入MSCs中，并通過WesternBlot方法驗證重組質(zhì)粒中靶基因的表達情況。
　　 5.轉(zhuǎn)染后MSCs分別記為IDO-1+組、COX-2+組、IDO-1+COX-2+組，并分別與PBMC共培養(yǎng)，運用CCK-8細胞計數(shù)試劑盒檢測不同組MSCs對淋巴細胞增殖能力的影響。
　　 6.通過實時定量PCR方法檢測免疫調(diào)控相關(guān)基因在IDO-1+組、CO

4、X-2+組、IDO-1+COX-2+組MSCs中的表達情況。
　　 結(jié)果:
　　 1.隨傳代次數(shù)增加，MSCs的長寬比增大，核質(zhì)比減小，代數(shù)大的細胞體積增大、邊緣不清晰、細胞內(nèi)顆粒增多。
　　 2.細胞衰老檢測試劑盒檢測結(jié)果顯示第13代MSCs的衰老細胞比例明顯增加。但在體外混合淋巴細胞培養(yǎng)體系中，第13代MSCs對淋巴細胞增殖的抑制作用與第5代相比明顯增強(P＜0.05)。
　　 3.與對照組相比，衰老

5、組MSCs免疫抑制相關(guān)基因(HO-1、IL-10、iNOS)表達增加，而炎性因子基因(IL-1α、IL-1β、IFN-γ)表達減弱。
　　 4.真核表達重組質(zhì)粒pEGFP-N3/IDO-1或pEGFP-N3/COX-2轉(zhuǎn)染入MSCs中，修飾后MSCs的IDO-1或COX-2基因表達上調(diào)，且能翻譯編碼更多的IDO-1蛋白、COX-2蛋白。
　　 5.IDO-1+組、COX-2+組的MSCs能夠更顯著的抑制淋巴細胞的增殖，I

6、DO-1+COX-2+組MSCs抑制淋巴細胞增殖的能力也得到加強但效果不顯著。
　　 6.IDO-1+MSCs主要表現(xiàn)為炎性因子相關(guān)基因(IL-1α、IL-1β、IFN-γ、IL-2)表達下調(diào)，而COX-2+MSCs主要為免疫抑制相關(guān)基因(IDO-1、HO-1、IL-10、iNOS)表達上調(diào)。
　　 結(jié)論:
　　 常氧條件下，MSCs隨體外培養(yǎng)代數(shù)的增加而逐漸衰老，但其免疫抑制能力逐漸增強。轉(zhuǎn)染入pEGFP-N3