基因修飾的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞介導(dǎo)人凝血因子Ⅸ的體內(nèi)外表達(dá).pdf

1、目的：血友病B是一種由于凝血因子IX(FIX)缺乏而導(dǎo)致的嚴(yán)重出血性疾病，為X染色體連鎖隱性遺傳。缺乏FIX的病人內(nèi)源性的凝血通路阻斷，導(dǎo)致了終生自發(fā)性的出血和外傷、手術(shù)后出血的延長。傳統(tǒng)的治療是基于靜脈內(nèi)輸入血漿來源的或重組的凝血因子蛋白。因?yàn)轭l繁的因子輸入所需巨大的費(fèi)用，故很少輸入因子來預(yù)防出血。結(jié)果反復(fù)發(fā)生關(guān)節(jié)的損害，致命的出血風(fēng)險仍然存在。遺傳性疾病的基因治療目的就是使丟失或缺陷基因得到長期和持續(xù)的表達(dá)。血友病B基因治療通常將一

2、野生型或最低限度地修飾的FIX轉(zhuǎn)移入體內(nèi)細(xì)胞中，這樣有生物活性的FIX能分泌入血液。使用的基因遞送系統(tǒng)必須是高效、安全、無免疫原性和能保證長期有效的基因表達(dá)。臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(HUCMSCs)具有高的增殖、分化能力和低的免疫原性，因而成為遺傳性疾病(包括血友病B)體外基因治療的迷人靶細(xì)胞。 方法：在HUCMSCs中表達(dá)人凝血因子IX，然后移植到小鼠體內(nèi)來觀察持續(xù)的FIX的分泌方法：構(gòu)建含人凝血因子IX cDNA和部分外顯子1序列

3、的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，并使用它來包裝逆轉(zhuǎn)錄病毒，病毒上清感染靶細(xì)胞HUCMSCs后G418篩選10天。使用Western Blot來證實(shí)轉(zhuǎn)導(dǎo)后的HUCMSCs培養(yǎng)上清有分泌型的hFIX。并用ELISA來測定上清的hFIx含量，使用人因子IX缺乏的血漿做凝集測定實(shí)驗(yàn)來測定上清hFIX的活性。將轉(zhuǎn)導(dǎo)hFIX的HUCMSCs皮下移植到免疫缺陷的NOD/SCID小鼠。鼠內(nèi)眥采血后，ELISA測定血清中hFIX的水平。 結(jié)果：轉(zhuǎn)導(dǎo)后的細(xì)胞體外

4、產(chǎn)生生理活性的hFIX。以正常人的血清hFIX的活性(100％)為參照，凝集測定實(shí)驗(yàn)證實(shí)了G418藥物篩選10天后的培養(yǎng)上清(兩天)的hFIX活性為100-130％和表達(dá)水平為2.68±0.36 μg/106 cells/24 h。Western blot實(shí)驗(yàn)證實(shí)了hFIX轉(zhuǎn)導(dǎo)的HUCMSCs分泌hFIX入培養(yǎng)上清，而轉(zhuǎn)導(dǎo)空載體的HUCMSCs上清沒有hFIX分泌。hFIX轉(zhuǎn)導(dǎo)的HUCMSCs(6×106細(xì)胞/鼠)皮下移植入免疫缺陷鼠中