PEDF基因修飾人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞對早期糖尿病大鼠視網(wǎng)膜PEDF及VEGF表達(dá)的影響.pdf

1、目的：
　　觀察色素上皮衍生因子基因修飾的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（pigment epithelial-derived factor gene-modifiedhuman umbilical cordmesenchymal stem cells，PEDF-MSCs）對早期糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中PEDF、血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）表達(dá)的影響及對視網(wǎng)膜的保護(hù)作用。

2、　　方法：
　　胰蛋白酶消化法獲取人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUCMSCs）并進(jìn)行體外擴(kuò)增，采用流式細(xì)胞學(xué)方法進(jìn)行鑒定其免疫表型。采用基因重組方法構(gòu)建慢病毒（lentivirus,LV）-PEDF載體并對其進(jìn)行基因測序。LV-PEDF以感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection,MOI）值為10、30、50體外轉(zhuǎn)染hUCMSCs，采

3、用實(shí)時定量聚合酶鏈反應(yīng)（real time quantitativepolymerase chain reaction,realtime-PCR）和酶聯(lián)免疫吸附測定法（enzyme linked immunosorbentassay,ELISA）分別檢測以最佳MOI值轉(zhuǎn)染細(xì)胞PEDF及VEGF信使核糖核酸（messengerribonucleic acid,mRNA）和蛋白水平表達(dá)。選取鏈脲佐菌素（streptozotocin,STZ）

4、腹腔注射誘導(dǎo)糖尿病大鼠模型。實(shí)驗(yàn)動物分為五組：正常對照組（N組）、糖尿病對照組（D組）、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline,PBS）治療組（B組）、綠色熒光蛋白標(biāo)記的間充質(zhì)干細(xì)胞（greenfluorescent proteinlabelledmesenchymal stem cells，GFP-MSCs）治療組（G組）及PEDF-MSCs治療組（P組）；造模成功后4個月進(jìn)行干預(yù)治療，P組與G組分別給予PE

5、DF-MSCs、GFP-MSCs，B組給予PBS治療，N組與D組不予特殊治療。玻璃體腔注射 PEDF-MSCs后2周，熒光顯微鏡觀察PEDF-MSCs在大鼠眼內(nèi)存活情況。成模后1，4，6個月分別進(jìn)行蘇木素伊紅（hematoxylin andeosin,HE）染色觀察視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)，測量內(nèi)叢狀層（inner plexiform layer,IPL）、內(nèi)核層（inner nuclear layer,INL）及外核層（outer nuclear

6、layer,ONL）視網(wǎng)膜厚度，并通過免疫組織化學(xué)法分別檢測各組大鼠視網(wǎng)膜中PEDF與VEGF的表達(dá)，real time-PCR檢測大鼠視網(wǎng)膜PEDF與VEGF在mRNA水平的表達(dá)。觀察治療后視網(wǎng)膜形態(tài)學(xué)特征及視網(wǎng)膜血管迂曲擴(kuò)張程度的變化。
　　結(jié)果：
　　胰蛋白酶消化法獲取的hUCMSCs表達(dá)CD105、CD73和CD90，不表達(dá)CD34、CD45、CD11b、CD19和HLA-DR。經(jīng)基因測序與對比分析（1257/125

7、7=100％），測序結(jié)果與目標(biāo)序列完全一致。最佳MOI值為50，轉(zhuǎn)染效率可達(dá)72.1%。Real time-PCR檢測結(jié)果顯示，PEDF-MSCs及對照組中PEDF mRNA相對表達(dá)量分別為（0.170±0.028）與（0.015±0.007），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.001）；兩組VEGF mRNA相對表達(dá)量分別為（0.265±0.022）與（0.285±0.049），差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。ELISA檢測顯示，轉(zhuǎn)染后PE

8、DF-MSCs上清液中PEDF蛋白表達(dá)高于對照組，VEGF蛋白表達(dá)低于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。腹腔注射STZ后總成模率達(dá)95%。玻璃體腔注射后2周，熒光顯微鏡下觀察到P組與G組大鼠玻璃體腔內(nèi)放射狀及簇狀排列的綠色熒光；視網(wǎng)膜中未發(fā)現(xiàn)明顯綠色熒光。HE染色顯示，糖尿病1個月，神經(jīng)纖維層（nerve fiber layer,NFL）出現(xiàn)水腫，IPL增厚；糖尿病4個月，NFL水腫進(jìn)一步加重，血管擴(kuò)張，IPL結(jié)構(gòu)疏松，INL

9、細(xì)胞排列紊亂；糖尿病6個月，NFL水腫進(jìn)一步加重，局部INL及外核層變薄。玻璃體腔注射PEDF-MSCs后，IPL水腫明顯減輕，INL與ONL層細(xì)胞排列規(guī)整。視網(wǎng)膜厚度測量分析結(jié)果顯示：玻璃體腔注射后2個月，P組IPL厚度顯著下降；INL與ONL厚度顯著增加。視網(wǎng)膜血管形態(tài)學(xué)分析結(jié)果顯示，玻璃體腔治療后2個月，P組血管化面積顯著降低。免疫組織化學(xué)法染色結(jié)果顯示：玻璃體腔治療后2個月，P組PEDF平均光密度值增加；VEGF平均光密度值下降