玻璃體腔移植人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)的神經(jīng)干細(xì)胞對(duì)糖尿病大鼠視網(wǎng)膜功能影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：
　　探討玻璃體腔注射人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells, hUCMSCs）體外誘導(dǎo)的神經(jīng)干細(xì)胞（neuronal stem cells, NSCs）及抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）單克隆抗體ranibizumab對(duì)糖尿病大鼠視網(wǎng)膜功能和形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響，比較兩種注射藥物的療效差異，探

2、討 hUCMSCs體外誘導(dǎo)的NSCs治療糖尿病視網(wǎng)膜病變（diabetic retinopathy, DR）的可能機(jī)制，為早期防治DR新的方案的提出提供理論依據(jù)。
　　方法：
　　實(shí)驗(yàn)選用健康成年雄性斯普拉格-杜勒(Sprague-Dawley，SD）大鼠63只，按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為正常對(duì)照組（A組，13只）及糖尿病造模組（50只）。糖尿病組經(jīng)腹腔注射鏈脲佐菌素（streptozotocin, STZ）誘導(dǎo)糖尿病模型，正常

3、對(duì)照組大鼠腹腔注射等容量0.1mol/L枸櫞酸緩沖液。建模4、10周時(shí)，進(jìn)行閃光視網(wǎng)膜電圖（flash electroretinogram, F-ERG）國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)暗適應(yīng)視桿細(xì)胞反應(yīng)（rodresponse, Rod-R）、暗適應(yīng)最大反應(yīng)（maximum response, Max-R）及暗適應(yīng)震蕩電位（oscillatory potentials, OPs）三項(xiàng)基本反應(yīng)的檢測(cè)，每只眼記錄3次取平均值，蘇木素伊紅（hematoxylin-

4、eosin, HE）染色后，光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察不同造模時(shí)間點(diǎn)視網(wǎng)膜形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化。證實(shí)模型成功后，將糖尿病組大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為糖尿病對(duì)照組（B組），玻璃體腔內(nèi)注射磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline, PBS）組（C組），hUCMSCs體外誘導(dǎo)的NSCs組（D組），ranibizumab組（E組），每組各9只大鼠，A、B組不進(jìn)行干預(yù)。實(shí)驗(yàn)前、干預(yù)后2、4、6周分別記錄各組大鼠F-ERG國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)三項(xiàng)暗適應(yīng)

5、基本反應(yīng)，每只眼記錄3次取平均值,干預(yù)后2、4、6周光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察不同處理時(shí)間點(diǎn)視網(wǎng)膜形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化。采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　結(jié)果:
　　1. F-ERG對(duì)造模前后糖尿病大鼠視網(wǎng)膜功能變化的檢測(cè):各組大鼠實(shí)驗(yàn)前暗適應(yīng)Rod-R的b波潛伏期及振幅、暗適應(yīng)Max-R的a、b波潛伏期及振幅及暗適應(yīng)OPs總振幅值差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。造模后4周，A組與糖尿病組比較僅OPs總振幅差異具有統(tǒng)計(jì)

6、學(xué)意義（P<0.05）。造模后10周，A組與糖尿病造模組比較，Max-R的b波潛伏期、振幅及OPs的總振幅差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)；造模成功分組后A組與B、C、D、E組比較，Max-R的b波潛伏期、振幅及OPs的總振幅差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均<0.05）；而B(niǎo)、C、D、E組間F-ERG各波比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均>0.05）。
　　2. F-ERG對(duì)干預(yù)后各組大鼠視網(wǎng)膜功能變化的檢測(cè):干預(yù)后2、4周，D、E組Rod

7、、 Max-R的b波振幅及OPs總振幅較B、C組顯著性增加(P均<0.05)， Max-R的b波潛伏期較B、C組顯著性下降(P均<0.05)；D、E組間，僅OPs總振幅差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。干預(yù)后6周，D組Rod、Max-R的a波、b波振幅及OPs總振幅較B、C、E組顯著性增加(P均<0.05)，Rod、Max-R的b波潛伏期較B、C、E組顯著性下降(P均<0.05)，且隨著時(shí)間延長(zhǎng)上述指標(biāo)均逐漸趨向正常；而E組與B、C組

8、相比，F(xiàn)-ERG各反應(yīng)指標(biāo)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。分別對(duì)5個(gè)實(shí)驗(yàn)組干預(yù)前、干預(yù)后2、4、6周4個(gè)時(shí)間進(jìn)行組內(nèi)比較， A組4個(gè)時(shí)間點(diǎn)各反應(yīng)波比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。B、C組僅OPs總振幅差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），且均隨著時(shí)間的推移OPs總振幅呈下降趨勢(shì)。D組Max-R的b波潛伏期、振幅及OPs總振幅4個(gè)時(shí)間點(diǎn)間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），Max-R的b波潛伏期隨著時(shí)間的推移呈下降趨勢(shì)，而b波振

9、幅及OPs總振幅呈升高趨勢(shì)。E組Rod-R的b波振幅、Max-R的a波振幅、Max-R的b波振幅、OPs總振幅4個(gè)時(shí)間點(diǎn)有顯著性差異（P<0.05），且隨著時(shí)間的推移4個(gè)指標(biāo)均呈先上升后下降的趨勢(shì)。
　　3. HE染色：造模后4周，A組和糖尿病組比較，視網(wǎng)膜各層組織結(jié)構(gòu)未見(jiàn)明顯差異；造模后10周，A組視網(wǎng)膜各層細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞內(nèi)界膜（internal limiting membrane, ILM）完整清晰，而糖尿病組視網(wǎng)膜各層細(xì)

10、胞數(shù)量減少且排布紊亂；干預(yù)后2周，A組視網(wǎng)膜各層細(xì)胞鏡下排布整齊，細(xì)胞ILM完整清晰；B、C組較A組視網(wǎng)膜各層細(xì)胞數(shù)量減少且排布紊亂，ILM連續(xù)性破壞并出現(xiàn)局部增厚的現(xiàn)象；D、E組和B、C組組織結(jié)構(gòu)無(wú)明顯差異。4周時(shí)，B、C組視網(wǎng)膜較2周時(shí)各層細(xì)胞更加不規(guī)則，數(shù)量逐漸減少,ILM的連續(xù)性進(jìn)一步破壞、局部增厚的范圍也加大，甚至可見(jiàn)視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖；D、E組各層細(xì)胞排列同樣不規(guī)則，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞（retinal ganglion

11、cel, RGCs）的數(shù)量較B、C組增多，血管擴(kuò)張情況不明顯。6周時(shí)，B、C、E組較D組RGCs數(shù)量減少，細(xì)胞核深染，神經(jīng)纖維層（Nerve fiber layer, NFL）變薄且水腫明顯；內(nèi)核層（inner nuclear layer, INL）變薄且結(jié)構(gòu)紊亂；外核層（outer nuclear layer, ONL）排列較亂，ILM完整性破壞更加嚴(yán)重。
　　結(jié)論:
　　1.玻璃體腔注射hUCMSCs體外誘導(dǎo)的NSCs及