人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞移植對大鼠脊髓損傷神經(jīng)功能恢復(fù)的評價.pdf

1、目的：中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后再生修復(fù)的研究一直是神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域的熱點。近年來，間充質(zhì)干細(xì)胞在神經(jīng)組織的修復(fù)、再生和功能重建中所起的促進(jìn)作用日益引起關(guān)注。干細(xì)胞移植于神經(jīng)系統(tǒng)疾病與損傷的模型后，可促進(jìn)損傷區(qū)的神經(jīng)修復(fù)和再生以及神經(jīng)功能的改善，為治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)缺血、變性、損傷性疾病及其它各種疾病展示了嶄新的希望。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、臍血間充質(zhì)細(xì)胞等均已被作為細(xì)胞來源用于脊髓損傷的神經(jīng)修復(fù)，并顯示其有促進(jìn)神經(jīng)再生及改善動物神經(jīng)恢復(fù)的功能。特別是骨髓

2、間充質(zhì)干細(xì)胞因具有良好的體內(nèi)、體外神經(jīng)分化潛能，是目前最被看好的干細(xì)胞來源之一。然而，作為MSCs經(jīng)典來源的骨髓組織，可隨老化而致干細(xì)胞含量及其增殖能力顯著降低。因此，尋找新的MSCs來源有著重要意義。最近從易于獲得、組織來源上較為原始的人臍帶組織中分離的MSCs，經(jīng)傳代培養(yǎng)和誘導(dǎo)證實其具有向神經(jīng)元樣細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞分化潛能，以適當(dāng)?shù)姆桨刚T導(dǎo)后可高比例地選擇性分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞。人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(hUCMSC)的優(yōu)勢還在于：①取材方

3、便，易于獲得；②無倫理和道德等方面的障礙；③分離得到的細(xì)胞形態(tài)、表型相對均一；④臍帶內(nèi)的MSCs含量高，且細(xì)胞增殖能力穩(wěn)定，可在短時間內(nèi)獲得足夠的細(xì)胞；⑤hUCMSC不表達(dá)HLA-DR分子，免疫源性較弱。本研究旨在體外研究的基礎(chǔ)上，觀察hUCMSCs移植到大鼠脊髓損傷模型后存活、分化情況以及對神經(jīng)功能恢復(fù)的影響，為細(xì)胞移植尋找一種新型的具有良好應(yīng)用前景的細(xì)胞來源提供理論依據(jù)，進(jìn)而為其在脊髓損傷治療中應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。 方法：hUCM

4、SC來源于剖腹產(chǎn)的正常胎兒臍帶，用組織塊培養(yǎng)法，經(jīng)傳代進(jìn)行擴(kuò)增，棄去未貼壁細(xì)胞，細(xì)胞傳3-6代，hUCMSCs流式細(xì)胞學(xué)檢測細(xì)胞表面抗原，首先證實其為臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞以備移植之用，移植時調(diào)至細(xì)胞終濃度1×105/μl。取SD大鼠70只，隨機(jī)分為3組：①脊髓半切+hUCMSC組(n=30)，②脊髓半切+PBS組(n=30)和③假手術(shù)組(n=10)。脊髓半切模型經(jīng)大鼠胸背后正中切口，咬除T8、9棘突和椎板，手術(shù)顯微鏡下用虹膜剪將T9左側(cè)半脊

5、髓剪斷。脊髓半切+hUCMSC組和PBS組又分為頭側(cè)注射、尾側(cè)注射和頭尾兩側(cè)注射三個亞組。微量注射器固定于立體定向架,hUCMSCs組將hUCMSCs懸液在10min內(nèi)緩慢注入到脊髓半切頭側(cè)(頭側(cè)注射組)或尾側(cè)(尾側(cè)注射組)損傷臨近區(qū)域的灰白質(zhì)交界處(距脊髓表面約0.7mm)，每點6μl，總細(xì)胞數(shù)6×105細(xì)胞；頭尾兩側(cè)注射組于半切頭尾兩側(cè)損傷臨近區(qū)各取一點注射，每點3μl，總細(xì)胞數(shù)亦為6×105細(xì)胞，留針5min，拔針后針孔用醫(yī)用生物

6、蛋白膠封閉以防細(xì)胞外漏。移植后1、7、14、21、28天觀察大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)情況，采用改良Tarlov評分對動物進(jìn)行行為學(xué)檢查，測量抓握、維持姿勢能力。于移植后28天用4％多聚甲醛灌注處死大鼠，取出脊髓損傷組織行連續(xù)冰凍橫切片，厚5μm；首先應(yīng)用MAB1281免疫組化染色檢測移植到脊髓的hUCMSC是否存活，然后行免疫組化雙標(biāo)染色檢測存活的hUCMSC膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)或神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)表達(dá)情況。 結(jié)論：