骨髓間充質(zhì)基質(zhì)細胞靜脈移植對腦缺血損傷后神經(jīng)功能恢復的影響.pdf

1、缺血性腦血管病的發(fā)病率正逐年增高，這種疾病對人類健康乃至生命的威脅使其愈來愈受到關(guān)注。急性腦缺血后，因缺血灶神經(jīng)細胞死亡而導致的神經(jīng)功能缺損至今尚缺乏真正有效的治療措施和藥物，因此如何促進腦缺血患者受損神經(jīng)功能的修復仍是目前研究的重點。九十年代初神經(jīng)干細胞(NSCs)的發(fā)現(xiàn)，打破了神經(jīng)元不能再生的傳統(tǒng)觀念，為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷修復注入了新的活力。NSCs的發(fā)現(xiàn)提示腦組織自身修復功能的存在，腦損傷后內(nèi)源性神經(jīng)干細胞的激活有助于受損神經(jīng)功能

2、的恢復，但其新生的神經(jīng)細胞數(shù)量有限，使受損細胞不能為足夠的新生細胞所替代，這種修復有其限制性。另外，外源性NSCs移植也可用于修復受損的神經(jīng)功能，但由于神經(jīng)干細胞取材、培養(yǎng)困難，而且有免疫排斥、來源受限、倫理道德的約束限制了其進一步應用。而骨髓來源的間充質(zhì)基質(zhì)細胞(Bone Marrow-derived MeSellchymal Stromal Cells，MSCs)具有取材、培養(yǎng)方便，可取自體骨髓進行自體移植，并有多種分化潛能等優(yōu)點，

3、因此MSCs如果在腦內(nèi)能夠大量分化成功能性神經(jīng)細胞，將是治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷修復的較為理想的細胞。本實驗通過成年大鼠局灶性腦缺血發(fā)生后靜脈注射移植間充質(zhì)基質(zhì)細胞(MSCs)初步闡明MSCs在大鼠腦內(nèi)增殖、遷移和分化的具體過程及其修復受損神經(jīng)功能的效果、機制，從而能為MSCs移植治療局灶性腦缺血疾病提供理論及實驗依據(jù)。 方法： 1．從2月齡Sprague-Dawley大鼠的長骨中取出骨髓細胞置于培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，利用MSCs

4、的貼壁生長特性，通過換液棄除懸浮生長的血細胞，將MSCs分離出來進行體外培養(yǎng)、擴增及純化。因為貼壁細胞可能同時混有淋巴細胞、單核細胞，故在細胞傳代時控制胰蛋白酶的消化時間在2-3min，在該時間段內(nèi)絕大部分MSCs可以從培養(yǎng)瓶上脫落，而淋巴細胞、單核細胞貼附性強仍貼附在培養(yǎng)瓶底。從而使MSCs得以進一步純化。流式細胞術(shù)檢測MSCs表面CD90/CD45表達情況來鑒定第三代MSCs，并通過體外誘導分化為脂肪細胞進一步鑒定。取第3-4代MS

5、Cs用于實驗。 2．健康雄性SD大鼠，隨機分為MCAO移植組、MCAO對照組。每組20只。采用線栓法制備大鼠局灶性腦缺血模型，以大鼠神經(jīng)功能障礙的出現(xiàn)作為腦缺血的整體評價，采用HE和TTC染色判斷腦缺血的部位及范圍。模型成功后第5d，MCAO移植組大鼠經(jīng)股靜脈注射總體積lml的MSCs單細胞懸液(含4×10<'6>個MSCs)，對照組以lml無血清培養(yǎng)液取代，然后進行下列處理：①根據(jù)神經(jīng)缺損評分標準，于大鼠MCAO術(shù)前，術(shù)后1

6、、7、14、21d分別進行神經(jīng)缺損評分；②MCAO術(shù)后21d各組大鼠隨機取5只做大腦TTC染色和梗死面積計算；③各組大鼠按：MCAO術(shù)后不同的飼養(yǎng)時間分別于第7d、14d、21d三個時間點隨機取5只處死。在第6d、13d、20d三個時間點大鼠腹腔注射5-嗅尿嘧啶(BrdtJ)以標記增殖細胞，在最后一次注射后1d隨機取5只處死，灌注取腦，多聚甲醛固定，石蠟包埋，制作石蠟切片。選用5-嗅尿嘧啶(BrdU)、神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)和膠

7、質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)作為增殖、分化的標記物。免疫組織化學染色方法檢測BrdU陽性細胞、BrdU和NSE雙陽性細胞以及BrdU和GFAP雙陽性細胞。依據(jù)以上檢測結(jié)果分析腦缺血后兩組大鼠內(nèi)源性神經(jīng)干細胞激活情況，MSCs在腦內(nèi)增殖、遷移和分化情況，以及兩組大鼠受損神經(jīng)功能修復的效果和機制。 結(jié)果： 1．通過換液、傳代，MSCs得到了純化。用抗CD45/CD90抗體通過流式細胞儀檢測第三代MSCs，發(fā)現(xiàn)細胞表面標志CD

8、90表達陽性的細胞已占到93﹪，細胞表面標志CD45表達陽性的細胞為1.7﹪，說明培養(yǎng)的細胞為MSCs且純度已達93﹪以上。而且向脂肪細胞誘導分化實驗中顯示，誘導14d時的細胞用脂肪特異性結(jié)合的染料油紅-O染色，結(jié)果大部分細胞的胞質(zhì)中的脂滴都被染為紅色，結(jié)果表明，該細胞在體外還可以向脂肪細胞分化。因此進一步證實本實驗培養(yǎng)的細胞確為間充質(zhì)基質(zhì)細胞，排除造血干細胞的可能性。 2.應用線栓法閉塞大鼠左側(cè)大腦中動脈后，大鼠出現(xiàn)以右上肢

9、為重的右側(cè)偏身癱瘓同時伴有左側(cè)Homor氏征。TTC和HE染色均顯示缺血區(qū)域位于左側(cè)紋狀體、顳頂區(qū)皮層，位置和范圍較為穩(wěn)定。 3.大鼠MCAO后21 d， MSCs移植組與對照組相比梗死體積差異無顯著性。局灶性腦缺血再灌注后14、21d，MSCs移植組神經(jīng)缺損評分明顯低于對照組(P值小于0.05)。 4.在同一時間點檢測到側(cè)腦室SVZ處、缺血灶及周邊腦區(qū)BrdU標記陽性細胞、BrdU+GFAP和BrdU+NSE雙標陽

10、性細胞的數(shù)量，都是移植組明顯多于對照組。經(jīng)靜脈注射移植的MSCs主要遷移到了缺血灶及周邊腦區(qū)、存活并增殖，部分MSCs可以分化為神經(jīng)元樣和星形膠質(zhì)細胞樣細胞，這些細胞主要分布于缺血區(qū)域的周圍。 5.MSCs組梗死區(qū)周圍GFAP陽性細胞與對照組在MCAO后14、21d這兩時間點比較都明顯減少。 結(jié)論： 1.本實驗用直接貼壁分離法從SD大鼠長骨中分離出間充質(zhì)基質(zhì)細胞并在體外培養(yǎng)成功，獲得具有增殖分化能力的純化的間充質(zhì)

11、基質(zhì)細胞。 2.大鼠線栓法MCAO模型是研究局灶性腦缺血后自身修復和內(nèi)源性神經(jīng)干細胞激活理想的動物模型。腦缺血后大鼠側(cè)腦室SVZ內(nèi)源性神經(jīng)干細胞增殖增加，BrdU染色證實這些細胞部分處于增殖狀態(tài)，遷移至缺血灶及周邊腦區(qū)，可逐漸分化為成熟的神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞。 3.腦缺血大鼠通過靜脈移植MSCs后，植入的細胞在缺血灶及周邊腦區(qū)增殖、遷移及分化并可能部分替代受損細胞，同時可能通過加強受體神經(jīng)發(fā)生區(qū)干細胞的激活、抑制膠質(zhì)瘢痕