Wnt3a基因修飾的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對T淋巴細(xì)胞增殖的影響.pdf

1、目的：以腺病毒為載體，制備Wnt3a基因修飾的小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)，觀察Wnt3a基因修飾的MSC對T淋巴細(xì)胞增殖的影響。
　　 方法：1．利用pAdEasy腺病毒載體系統(tǒng)構(gòu)建含鼠Wnt3a基因的重組腺病毒表達(dá)載體，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法在HEK293細(xì)胞中進(jìn)行病毒包裝和擴(kuò)增，有限稀釋法測定病毒滴度；2．從C57BL/6小鼠骨髓中分離培養(yǎng)MSC，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞表面標(biāo)志和誘導(dǎo)成骨成脂分化進(jìn)行鑒定；用高滴度腺病毒液感染第6代

2、MSC，空載體腺病毒(pAd-GFP)作對照，熒光顯微鏡下評估感染效率，Western blot技術(shù)檢測Wnt3a蛋白在MSC的表達(dá)情況；制備BALB/c小鼠脾淋巴細(xì)胞懸液，Wnt3a基因修飾的MSC、pAd-GFP轉(zhuǎn)導(dǎo)MSC分別按1:100、1:50及1:10比例和ConA刺激的脾淋巴細(xì)胞在Transwell培養(yǎng)板中共培養(yǎng)，72 h后應(yīng)用CCK-8法、ELISA法檢測T淋巴細(xì)胞的增殖相對數(shù)和培養(yǎng)上清液中IL-2、IFN-γ的含量變化，

3、同時用Western blot技術(shù)檢測共培養(yǎng)期間MSC中β-catenin蛋白的表達(dá)水平變化。
　　 結(jié)果：1．成功構(gòu)建表達(dá)鼠Wnt3a基因的重組腺病毒表達(dá)載體，包裝的腺病毒滴度達(dá)1010pfu/ml;2．分離培養(yǎng)的MSC經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測顯示高表達(dá)CD44、CD90.2（表達(dá)率在95％以上），而不表達(dá)CD34、CD45（表達(dá)率低于1％），誘導(dǎo)后可向成骨成脂分化，符合MSC特征；當(dāng)重組腺病毒多重感染復(fù)數(shù)(MOI)值為100時，MS

4、C可被有效感染，病毒感染后72h熒光表達(dá)最強(qiáng)，感染效率為50％-60％，Western blot結(jié)果顯示基因修飾的MSC中Wnt3a蛋白的表達(dá)水平明顯增強(qiáng)；在混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)中，MSC對T淋巴細(xì)胞增殖的抑制作用呈劑量依賴性，在1：10比例下共培養(yǎng)72h后，相對單獨ConA刺激T淋巴細(xì)胞對照組，pAd-GFP轉(zhuǎn)導(dǎo)MSC組T淋巴細(xì)胞增殖率下降為(55.41±1.75)％，分泌的IFN-γ由(674.76±17.78) pg/ml減少為(32

5、6.70±14.41) pg/ml;而Wnt3a基因修飾的MSC組T淋巴細(xì)胞增殖抑制率下降為(37.27±2.66)％，分泌的IFN-γ減少為(218.80±12.93) pg/ml，但各MSC對IL-2的分泌無明顯影響（P＞0.05）。同時Western blot結(jié)果顯示共培養(yǎng)期間Wnt3a基因修飾的MSC中β-catenin蛋白的表達(dá)水平明顯增強(qiáng)。
　　 結(jié)論：構(gòu)建了腺病毒載體介導(dǎo)的鼠Wnt3a基因修飾的MSC，重組腺病毒能