肺腫瘤細(xì)胞來(lái)源的外泌體對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)影響及機(jī)制研究.pdf

1、腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移與腫瘤微環(huán)境密切相關(guān)。腫瘤微環(huán)境是由間充質(zhì)干細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、免疫細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)等共同構(gòu)成的局部微環(huán)境。腫瘤細(xì)胞與腫瘤微環(huán)境的各種成分之間相互作用，相互影響，從而促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（Epithelial-Mesenchymal Transition，EMT）、血管生成等。
　　間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem/stromal cells，MSCs）是一類(lèi)成體干細(xì)胞，來(lái)源于骨髓、脂肪等體

2、內(nèi)多種組織，具有自我更新和成脂、成骨、成軟骨等多系分化能力。MSCs還具有重要的免疫調(diào)節(jié)功能，能夠抑制T細(xì)胞和B細(xì)胞的增殖，影響DC細(xì)胞的分化成熟。MSCs還可以被腫瘤細(xì)胞募集到腫瘤組織中，形成腫瘤微環(huán)境中的重要組成成分。
　　腫瘤細(xì)胞可以通過(guò)細(xì)胞-細(xì)胞間的直接接觸或者旁分泌的方式影響周?chē)募?xì)胞，從而促進(jìn)腫瘤自身的生長(zhǎng)和發(fā)展。外泌體(exosomes)是細(xì)胞分泌的一種囊泡結(jié)構(gòu)，大小在30到100nm之間，由磷脂雙分子層包裹形成。外

3、泌體中含有大量功能性蛋白質(zhì)、mRNA、miRNA、DNA片段等多種生物活性物質(zhì)，可以介導(dǎo)細(xì)胞之間的物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和信息傳遞。越來(lái)越多的研究表明，腫瘤細(xì)胞可以通過(guò)分泌的外泌體對(duì)腫瘤微環(huán)境中的多種成分產(chǎn)生影響。因此，研究腫瘤外泌體在腫瘤微環(huán)境中的作用及機(jī)制，不僅對(duì)于認(rèn)識(shí)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移等有著重要的意義，而且對(duì)于腫瘤的診斷、防治和預(yù)后亦有著重要的作用。
　　目的:實(shí)驗(yàn)室的前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的外泌體可以促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的遷移。

4、但腫瘤細(xì)胞分泌的外泌體對(duì)募集過(guò)來(lái)的間充質(zhì)干細(xì)胞有哪些影響、又是通過(guò)什么樣的機(jī)制實(shí)現(xiàn)的？目前尚不清楚。本篇論文致力于研究肺腫瘤細(xì)胞系A(chǔ)549來(lái)源的外泌體對(duì)脂肪來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞（adipose-derived mesenchymal stem/stromal cells，AMSCs）的生物學(xué)影響及分子機(jī)制研究。
　　方法:為了研究肺腫瘤細(xì)胞來(lái)源的外泌體對(duì)脂肪來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞有哪些影響，在論文的第一部分，首先從脂肪組織中分離提取了間充質(zhì)

5、干細(xì)胞并對(duì)其進(jìn)行表型和分化能力進(jìn)行鑒定。然后從肺腫瘤細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞培養(yǎng)上清中分離提取外泌體，對(duì)其進(jìn)行電鏡形態(tài)觀(guān)察和免疫印跡鑒定。使用熒光染料PHK67或DiO標(biāo)記A549細(xì)胞來(lái)源的外泌體，然后觀(guān)察其能否被AMSCs攝取。最后，對(duì)A549細(xì)胞外泌體處理過(guò)的AMSCs進(jìn)行系統(tǒng)性研究，觀(guān)察其形態(tài)、表型、成骨分化、成臘分化、基因表達(dá)譜、炎癥因子分泌譜、增殖、細(xì)胞周期、遷移及促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)的能力等是否發(fā)生變化。在論文的第二部分，選取A549細(xì)胞

6、外泌體影響AMSCs炎癥因子分泌的現(xiàn)象進(jìn)行了具體機(jī)制研究。首先使用Toll樣受體信號(hào)通路芯片檢測(cè)發(fā)生變化的基因，選取其中的關(guān)鍵基因使用小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)和中和抗體來(lái)阻斷關(guān)鍵基因的表達(dá)和作用，研究其對(duì)AMSCs炎癥因子分泌的影響。最后，篩選A549細(xì)胞外泌體中的哪種成分對(duì)AMSCs炎癥因子分泌產(chǎn)生影響，并通過(guò)中和抗體和體外重組蛋白來(lái)驗(yàn)證其作用。
　　結(jié)果:論文的第一部分顯示A549

7、細(xì)胞來(lái)源的外泌體可以被AMSCs攝取，影響其基因表達(dá)譜和炎癥因子分泌譜，顯著增加其促炎因子IL-6、IL-8和趨化因子MCP-1的表達(dá)，形成一種促炎型的PMSCs(pro-inflammatory AMSCs)。A549細(xì)胞來(lái)源的外泌體還可以抑制AMSCs的成脂成骨分化，增強(qiáng)其遷移能力，對(duì)其增殖及細(xì)胞周期影響不大。裸鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)表明PMSCs在體內(nèi)可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)及巨噬細(xì)胞的募集。第二部分研究結(jié)果顯示，A549細(xì)胞來(lái)源的外泌體可

8、以激活A(yù)MSCs的NF-κB信號(hào)通路，導(dǎo)致p-IKKα/β、p-p65蛋白增加，p65蛋白入核。AMSCs細(xì)胞的TLR2參與了NF-κB信號(hào)通路激活的過(guò)程，阻斷TLR2信號(hào)通路可以抑制NF-κB信號(hào)通路的活化及促炎因子的表達(dá)。A549細(xì)胞來(lái)源的外泌體中的HSP70蛋白可以通過(guò)TLR2促進(jìn)AMSCs促炎因子的表達(dá)，HSP70的中和抗體可以抑制腫瘤細(xì)胞外泌體的促炎功能，體外重組蛋白HSP70與腫瘤細(xì)胞外泌體則具有相似的促炎效果。