間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體對(duì)急性肺損傷小鼠的影響及相關(guān)機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景與目的:
　　急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）是臨床常見的危重病癥，其起病急驟，病情兇險(xiǎn)，死亡率高。ARDS的常見病因?yàn)楦腥荆匕Y感染極易導(dǎo)致膿毒癥的發(fā)生，而膿毒癥是多器官衰竭包括ARDS的前奏。盡管國內(nèi)外學(xué)者針對(duì)膿毒癥致ARDS的治療進(jìn)行了大量的研究，但總的看來，結(jié)果不能令人滿意，其病死率仍高達(dá)40％以上。
　　間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal

2、stem cells，MSCs）具有多向分化能力，取材簡便，提取過程較簡單，不會(huì)發(fā)生免疫排斥反應(yīng)具有重要的免疫調(diào)節(jié)和抗炎活性，是理想的組織修復(fù)來源，一系列臨床前研究證實(shí)其能顯著改善ARDS的癥狀及預(yù)后。但是直接移植具有致瘤、栓塞、異常分化、免疫調(diào)節(jié)不可控等風(fēng)險(xiǎn)，對(duì)其應(yīng)用造成限制。
　　間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體(exosomes)是MSCs在靜息或活化狀態(tài)下釋放到細(xì)胞外基質(zhì)中的膜分泌體系，不僅含有間充質(zhì)干細(xì)胞的活性物質(zhì)，而且具有選擇性組裝

3、、靶向性投遞、高效修復(fù)受損組織、安全性高，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定易于保存等優(yōu)點(diǎn)，是干細(xì)胞領(lǐng)域具有重要研究價(jià)值的新興熱點(diǎn)。
　　本研究擬將間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體用于急性肺損傷小鼠模型的干預(yù)治療，從生存率、損傷程度、通透性改變、炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)等五方面評(píng)價(jià)間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體的生物學(xué)效應(yīng)并探討其相關(guān)的機(jī)制，為ALI的治療探索新方法。
　　方法與結(jié)果:
　　首先分離出MSCs，分離過程采用組織細(xì)胞貼壁法，分離后培養(yǎng)和擴(kuò)增至第三代，然后

4、通過流式細(xì)胞儀檢測表明標(biāo)志物，分化誘導(dǎo)培養(yǎng)對(duì)MSCs進(jìn)行成脂、成骨和成軟骨鑒定，最后采用超高速離心法得到MSCs上清中的外泌體，并對(duì)外泌體進(jìn)行表面標(biāo)志物的鑒定。采用盲腸結(jié)扎穿孔法（Cecal ligation perforation，CLP）建立ALI小鼠模型，然后將200只小鼠隨機(jī)地分為正常對(duì)照組即生理鹽水組(Saline組)、CLP加尾靜脈注入等量生理鹽水對(duì)照組（CLP+Saline組）、CLP加尾靜脈注入去除外泌體MSC濃縮上清對(duì)

5、照組（CLP+ExD-CM組）和CLP加尾靜脈注入外泌體實(shí)驗(yàn)組（CLP+Exsomes組）。結(jié)果顯示:在6h和24h時(shí)間點(diǎn)，CLP+Exsomes實(shí)驗(yàn)組肺組織病理切片的病變程度明顯減輕，病理評(píng)分有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;CLP+Exsomes實(shí)驗(yàn)組肺濕干比和肺泡灌洗液(BALF)中總蛋白含量與對(duì)照組CLP+Saline和CLP+ExD-CM比較明顯減低;CLP+Exsomes實(shí)驗(yàn)組BALF中中性粒細(xì)胞數(shù)量和肺組織髓過氧化物酶(MPO)的活性與對(duì)照組

6、比較明顯降低;CLP+Exsomes實(shí)驗(yàn)組BALF中和血漿中促炎因子水平與對(duì)照組相比明顯降低而抗炎因子水平明顯增高;另外隨機(jī)將40只小鼠分為同樣的4組單獨(dú)測試生存率，最終結(jié)果提示與對(duì)照組相比，CLP+Exsomes組7天生存率明顯增高;CLP+Exsomes實(shí)驗(yàn)組肺組織抗氧化應(yīng)激酶如超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)比對(duì)照組明顯增高;免疫組化示CLP+Exsomes實(shí)驗(yàn)組肺組織誘導(dǎo)型一氧化

7、氮合酶iNOS陽性的細(xì)胞較對(duì)照組減少，且肺組織反應(yīng)脂質(zhì)過氧化活性的丙二醛(MDA)濃度明顯降低;肺組織免疫蛋白印記顯示CLP+Exsomes實(shí)驗(yàn)組肺組織MAPK、NF-kB表達(dá)明顯降低，而血紅素加氧酶-1(HO-1)、Nrf-2明顯增高。
　　結(jié)論:
　　1.運(yùn)用組織細(xì)胞貼壁法能成功從人臍帶中分離MSCs，并可在體外培養(yǎng)擴(kuò)增。
　　2.運(yùn)用超高速離心法能成功從人臍帶MSCs上清中提取外泌體，其表達(dá)CD9、CD63、 C