間充質(zhì)干細胞旁分泌機制修復大鼠急性肺損傷的基礎(chǔ)研究.pdf

1、急性肺損傷(acute lung injury，ALI)和急性呼吸窘迫綜合(acuterespiratory distress syndrome，ARDS)是臨床常見的呼吸系統(tǒng)危重疾病，發(fā)展快，病死率高，社會危害重。ALI和ARDS常由創(chuàng)傷、感染、膿毒癥、休克、體外循環(huán)和廣泛的燒傷等因素引起。ALI患者如果不及時治療常發(fā)展為ARDS。目前間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cell，MSC)用于肺部疾病的基礎(chǔ)研究和治療多有報

2、道，國內(nèi)外研究學者從不同角度探討MSC用于ALI和ARDS治療的作用機制。盡管有關(guān)干細胞用于ALI治療的基礎(chǔ)研究報道較多，但機制仍未完全闡明。
　　肺泡上皮細胞在肺泡液清除過程發(fā)揮重要作用，肺泡上皮細胞清除肺泡內(nèi)電解質(zhì)和水分子的作用被定義為(Alveolar fluid clearance，AFC)，MSC分泌的生長因子可能具有促進肺泡上皮細胞的轉(zhuǎn)運離子和水分子功能，從而保持肺泡的干燥。AFC對于判斷病人的預后有重要的參考價值，A

3、LI過程合并AFC的受損，AFC與患者的死亡率密切相關(guān)。
　　所以本課題基于MSCs緩解炎癥反應，降低急性肺損傷，但MSCs修復受損的AFC報道較少，機制不明。AT-Ⅱ細胞受損后AFC能力降低，AFC對判斷患者的預后有重要參考價值，所以探明MSCs旁分泌機制修復肺上皮細胞的AFC能力具有重要的意義。
　　方法:
　　1.骨髓間充質(zhì)干細胞的分離培養(yǎng)及鑒定:麻醉并處死SD大鼠，分離大鼠股骨及脛骨骨髓腔內(nèi)細胞至培養(yǎng)皿，細胞貼

4、壁法分離培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow-MSC，BM-MSC).24小時后更換培養(yǎng)基，此后每三天剛換一次培養(yǎng)基，放置細胞孵箱內(nèi)培養(yǎng)(5％C02，37℃)。細胞生長至80％酶消化法傳代，3-6代細胞用于實驗。應用流式細胞術(shù)檢測技術(shù)鑒定細胞表面標記物，使用成脂及成骨誘導培養(yǎng)基培養(yǎng)BM-MSCs，鑒定MSC多項分化潛能。單克隆實驗鑒定細胞自我復制能力，應用流式細胞技術(shù)檢測BM-MSC表面標記物。
　　2.肺二型上皮細胞

5、的分離培養(yǎng)及鑒定:麻醉并處死SD大鼠，消毒、抗凝后放置超凈臺。打開胸腔，沖洗肺循環(huán)至肺組織發(fā)白。剪出肺組織使用PBS液沖洗肺遠端氣道。利用胰蛋白酶消化、差速離心、細胞貼壁的方法分離大鼠AT-Ⅱ細胞。DMEM/F12培養(yǎng)細胞，利用免疫熒光技術(shù)，肺泡表面活性物質(zhì)(surfactant protein A，SP-A)鑒定大鼠AT-Ⅱ細胞。
　　3.共培養(yǎng)模型的建立:本實驗探索MSCs旁分泌機制修復受損后的AT-Ⅱ細胞，建立共培養(yǎng)體系。<

6、br>　　4.AT-Ⅱ細胞細胞增殖實驗:利用CCK-8試劑檢測AT-Ⅱ在炎癥刺激后增殖情況以及共培養(yǎng)后MSCs對AT-Ⅱ細胞的影響作用。首先AT-Ⅱ(1×104)于上室培養(yǎng)，建立炎癥環(huán)境，構(gòu)建炎癥環(huán)境的三個主要促炎癥因子TNF-α、IL6和IL1-β，因子濃度分別為1.7ng/ml，87.6ng/ml和4.4ng/ml用以損傷AT-Ⅱ;正常培養(yǎng)基DMEM/F12培養(yǎng)AT-Ⅱ細胞作為陰性對照；MSCs與炎癥刺激后的AT-Ⅱ共培養(yǎng)。連續(xù)觀察

7、72h測定細胞增殖，應用酶標儀(450nm)測定光密度。
　　5.KGF分泌以及KGF-SiRNA干擾效率分析:MSC促進炎癥刺激后AT-Ⅱ的增殖活性。我們建立了如下四種共培養(yǎng)體系，各組的實驗條件如下:①MSCs，②MSCs+cytomix，③MSCs+AT-Ⅱ細胞，④AT-Ⅱ cells+ cytomix。下小室培養(yǎng)MSCs，或在上小室內(nèi)培養(yǎng)AT-Ⅱ。共培養(yǎng)48小時取培養(yǎng)基上清，利用ELISA方法測定KGF的分泌。利用lipof

8、ectamine2000為載體轉(zhuǎn)染KGF-SiRNA，在轉(zhuǎn)染48小時后測定KGF分泌水平，了解SiRNA的干擾效率。Cytomix包括TNF-α、IL6和IL1-β等炎癥因子。
　　6.MSCs靜脈注入大鼠肺內(nèi)示蹤:利用脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)(10mg/kg)經(jīng)鼠尾靜脈注射構(gòu)建大鼠ALI模型，4h后經(jīng)鼠尾靜脈注射DiI標記的MSCs(5×105)。MSCs注射后15min，2h，24h and72h

9、分別麻醉并處死大鼠，獲取肺組織，利用小動物成像技術(shù)分析MSCs注射大鼠體內(nèi)后肺內(nèi)留存。同時制作15min，24h and72h時間點的肺組織冰凍切片，了解MSCs在注射大鼠肺組織后肺內(nèi)分布。
　　7.病理評價及肺濕/干比:7-8周的大鼠隨機分配成6組，第一組大鼠注射PBS液;第二組注入LPS，4h后注射PBS;第三組注射LPS，4h后注射MSCs;第四組注射LPS，4h后注射KGF-SiRNA;第五組注射LPS，4h后注射lipo

10、fectamine2000;第六組注射MSCs。72h后麻醉并處死大鼠并獲取肺組織，右側(cè)肺葉制作石蠟切片并HE染色，左肺葉測濕/干重。
　　8.α1和β1亞基的蛋白及基因分析:建立體外共培養(yǎng)體系，體外實驗條件如下:AT-Ⅱ細胞+PBS（對照組），炎癥攻擊AT-Ⅱ cells+PBS，3）AT-Ⅱ細胞+MSCs，4）炎癥攻擊AT-Ⅱ細胞+MSCs，5）炎癥攻擊AT-Ⅱ細胞+MSCs(KGF-siRNA)，6)炎癥攻擊AT-Ⅱ細胞+M

11、SCs-lipof。模擬炎癥環(huán)境TNF-α、IL6and IL1-β(1.7ng/ml，87.6ng/ml and4.4ng/ml)。共培養(yǎng)72h后分別應用蛋白免疫印跡(Western blot)及實時定量聚合酶聯(lián)反應(quantitativepolumerase chain reaction，qPCR)分析Na-K-ATPaseα1和β1亞基的改變。
　　9.PI3K/Akt/mTOR信號通路分析:為進一步分析MSCs修復AT-

12、Ⅱ的可能機制。通過Western blot分析MSCs與AT-Ⅱ cells共培養(yǎng)后AT-Ⅱ的蛋白p-AKT、AKT、p-mTOR和mTOR改變。
　　10.統(tǒng)計學分析:本試驗數(shù)據(jù)均為計量資料，所有數(shù)據(jù)表達為X±SD，采用SPSS13.0分析軟件。單組計量資料采用采用one-sample t test;3組以上獨立樣本采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，進一步多重比較采用LSD;重復測量資料采用重復測量數(shù)據(jù)方差分析，

13、P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)果:
　　1.大鼠BM-MSC在培養(yǎng)皿呈貼壁、成纖維樣生長。3-8代的骨髓間充質(zhì)干細胞用于實驗。細胞穩(wěn)定表達CD29，CD44，CD90和CD105，陰性表達CD34 andCD45。BM-MSC從單個細胞到克隆形成，提示其自我復制能力。脂肪誘導及成骨誘導培養(yǎng)后鑒定呈陽性。肺二型上皮細胞經(jīng)分離培養(yǎng)后呈現(xiàn)圓形、鋪路石樣貼壁生長。經(jīng)肺泡表面活性物質(zhì)A(surfactant protein

14、 A，SP-A)抗體標記，免疫熒光檢測呈陽性表達。
　　2.CCK-8方法測定AT-Ⅱ細胞在炎癥損傷后，細胞增殖呈現(xiàn)下調(diào)趨勢;AT-ⅡⅡ與MSCs經(jīng)共培養(yǎng)后細胞增殖呈現(xiàn)上調(diào)趨勢。提示MSCs通過旁分泌作用促進AT-Ⅱ細胞的增殖。
　　3.MSC在無血清DMEM/F12條件下培養(yǎng)48小時檢測KGF濃度為437.65 pg/ml，炎癥刺激后KGF濃度為884.17 pg/ml;當MSCs與AT-Ⅱ細胞共培養(yǎng)條件下KGF濃度為38

15、2.37 pg/ml;AT-Ⅱ分泌KGF濃度明顯較少。說明在二者的共培養(yǎng)體系內(nèi)MSCs是KGF的主要來源。使用cy5標記的SiRNA轉(zhuǎn)染MSCs，結(jié)果提示大多數(shù)MSCs被成功轉(zhuǎn)染SiRNA。MSCs被轉(zhuǎn)染KGF-SiRNA后，KGF的分泌明顯降低。
　　4.DiI標記MSCs經(jīng)鼠尾靜脈注入大鼠體內(nèi)。小動物成像技術(shù)觀察注射后15min肺內(nèi)有大量的MSCs存留，但在2h和24h時間點MSCs在肺內(nèi)逐步減少，72h肺內(nèi)依然有MSCs留存

16、，但細胞光強值明顯下降。冰凍切片提示注射后15min肺內(nèi)MSCs呈聚集現(xiàn)象，在24h與72h時間點細胞在肺內(nèi)散在分布，在肺泡內(nèi)可見DiI標記的MSCs。
　　5.大鼠鼠尾靜脈注射LPS病理結(jié)果提示肺泡內(nèi)炎性滲出和肺泡間隔增厚。注射MSCs后肺泡炎性滲出液減少和肺泡間隔變小。KGF-SiRNA轉(zhuǎn)染MSC后，MSC的治療作用減弱。肺組織濕/干比在大鼠注入LPS后升高。繼LPS鼠尾靜脈注入MSCs濕/干下降，LPS后大鼠注入KGF-Si

17、RNA轉(zhuǎn)染的MSCs，濕/干比上升。
　　6.α1和β1亞基在炎癥因子損傷下，在蛋白和基因水平二者的表達均下降。
　　結(jié)論:
　　1.MSCs在炎性條件比非炎性條件分泌更多的KGF。DiI標記的MSCs注入大鼠體內(nèi)，早期肺內(nèi)留存較多，后逐步下降，在注射后72后MSCs在肺內(nèi)依然有存留。
　　2.大鼠注入LPS后肺內(nèi)炎性滲出增加，濕/干比升高，注入MSCs后肺泡內(nèi)液體消失，濕/干比重下調(diào)，MSC可能通過促進AFC的