大鼠外周血間充質(zhì)干細胞的富集及生物學特性研究.pdf

1、目的：探究大鼠外周血間充質(zhì)干細胞（PBMSC）有效的富集方法，并評價其表型特征、生長曲線、集落形成率以及體外培養(yǎng)向中胚層多系分化能力，為PBMSC作為間充質(zhì)干細胞（MSC）的種子細胞新來源用于治療難治性組織損傷性疾病提供有價值的實驗依據(jù)。
　　方法：①選用4周齡SD大鼠，按100?g/kg/day的劑量每日一次連續(xù)5天皮下注射粒細胞集落刺激因子（G-CSF）進行干細胞動員；經(jīng)左心腔采血，用密度梯度離心法分離出單個核細胞，繼而用貼壁

2、培養(yǎng)法得到成纖維樣集落生長細胞；細胞培養(yǎng)至第2代，用流式細胞術（CD90、CD44、CD29、CD45、CD11b和CD79a）和免疫細胞化學染色法（CD73、CD105、CD34和HLA-DR）分析分離、培養(yǎng)的PBMSC的表型特征。②MTS檢測繪制第2代（P2）PBMSC的生長曲線，并計算細胞倍增時間；采用龍膽紫染色法分析比較 G-CSF動員和未動員的SD大鼠外周血CFU-F的集落形成率（CFE）。③取生長良好的P2代PBMSC，用商

3、品化誘導培養(yǎng)基誘導其向成骨、成軟骨以及成脂細胞分化，于誘導21天后，分別采用茜素紅、阿利新藍和油紅O染色分析誘導效果。
　　結(jié)果：①外周血單個核細胞原代培養(yǎng)至6～7天可見明顯的成纖維樣細胞的集落樣生長，培養(yǎng)至21天細胞生長匯合度可達80％；傳代細胞貼壁能力強，形態(tài)均一，呈梭形漩渦狀生長。②FCM和免疫組化結(jié)果表明，富集的PBMSC高表達CD90、CD44、CD29、CD73及CD105，不表達CD45、CD11b、CD79a、CD

4、34和HLA-DR。③生長曲線顯示，傳代培養(yǎng)的PBMSC增殖能力強，于培養(yǎng)次日即可進入對數(shù)生長期，細胞倍增時間為39.2 h；CFU-F集落形成率的結(jié)果表明，動員后的大鼠 PBMSC的集落形成率為(15.67±2.07)/106，而未動員組僅為(0.33±0.58)/106，兩者比較差異顯著（P﹤0.01）。④PBMSC的中胚層系分化能力誘導培養(yǎng)結(jié)果表明，經(jīng)成骨誘導分化21天后，茜素紅染色有明顯的鈣結(jié)節(jié)形成；經(jīng)軟骨細胞誘導分化21天后，