骨髓間充質干細胞的生物學特性和靶向燙傷創(chuàng)面愈合的研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、皮膚是阻止微生物、化學物質等侵入以維持內環(huán)境穩(wěn)定的屏障,燒傷主要損害是皮膚壞死,大面積皮膚缺損可引起全身的改變。因而創(chuàng)面處理是燒傷救治的重要環(huán)節(jié)之一,大面積皮膚缺損創(chuàng)面的覆蓋與修復一直是臨床醫(yī)師倍感棘手的問題。燒傷創(chuàng)面的修復是一個十分復雜的生物學過程,包括炎癥反應、細胞增殖和遷移、膠原與細胞外基質的沉積以及再上皮化等。目前,燒傷創(chuàng)面修復方法主要是以局部治療為主。大面積深度燒傷患者由于自體皮源不足,多年來運用網狀植皮、郵票植皮、小皮片移植

2、、微粒植皮等技術來擴大皮膚覆蓋面積,取得了較好的臨床效果。但這些方法皮膚擴增面積有限,難以滿足大面積皮膚缺損患者盡早封閉創(chuàng)面的需求,在加快創(chuàng)面愈合的速度和改進創(chuàng)面愈合質量,從而在減少功能障礙的發(fā)生率和提高患者生活質量方面,目前常規(guī)應用的這些方法顯然還存在著很多不足。 組織工程學的興起和發(fā)展,為臨床解決這一難題提供了嶄新的思路和途徑。組織工程將體外分離、培養(yǎng)的高濃度的功能相關的活細胞種植于天然的、人工合成的支架上,使之植入人體后能

3、夠形成新的有功能的組織,來制造、保存或修復失去的組織功能。組織工程化人體組織或器官產業(yè)化生產的一個關鍵因素是植入足夠數量的、不引起免疫反應的、具有再生活力的細胞。其中種子細胞的體外培養(yǎng)擴增成為組織工程學中的重要環(huán)節(jié)。理想的種子細胞應具有容易獲得,容易體外培養(yǎng)增殖,長期傳代不改變生物學特征,抗原性小,組織修復能力強等特征。目前,有關皮膚種子細胞的研究主要集中在表皮細胞大規(guī)模培養(yǎng)和表皮干細胞研究,以及胚胎干細胞向表皮細胞定向誘導分化等幾個方

4、面。表皮細胞大規(guī)模培養(yǎng)雖已有成功應用的報道,但仍存在生產周期長、技術要求高和費用昂貴等諸多限制:正常皮膚內表皮干細胞數量有限,而大面積深度燒傷患者表皮干細胞來源更有限。同時表皮干細胞的分離、純化和培養(yǎng)技術尚不夠成熟;在胚胎干細胞方面,牽涉到倫理、技術等諸多障礙。因此有必要探索一條新的途徑來克服皮膚種子細胞的技術難度和瓶頸問題。 近年來研究發(fā)現,骨髓組織除含有造血干細胞外,還含有另一類干細胞——骨髓間充質干細胞(mesenchyma

5、l stem cells,MSCs)。MSCs具有干細胞的共性,即自我更新及多向分化能力。大量研究證實,在一定誘導條件下MSCs可向成骨細胞、成軟骨細胞、成肌細胞、肌腱細胞、脂肪細胞及基質細胞等中胚層細胞分化;同時MSCs還可以向外胚層的神經元細胞和內胚層的肝卵圓細胞分化。已有研究表明,把骨髓MSCs植入體內,可向多種造血以外的組織如肺、骨、軟骨和皮膚等處定位并分化為相應的組織細胞。骨髓間充質干細胞不僅具有無限增殖、多向分化的潛能,而且

6、還有明顯的可塑性,體內移植后能遷移到病變部位并轉化為病變部位的細胞等特點。骨髓MSCs獲取簡便,簡單的骨髓穿刺即可獲得,體外培養(yǎng)條件不高,細胞分裂增殖快,MSCs可取自自體,不存在免疫排斥問題,即便是異體移植,由于骨髓MSCs屬于未分化的前體細胞,其細胞表型的分化尚不成熟,因而MSCs移植排斥反應弱。而且MSCs體外基因轉染率高,故MSCs被認為是良好的組織工程的種子細胞,具有潛在的臨床應用前景。由此可見MSCs有可能作為皮膚組織工程的

7、種子細胞,參與燒傷創(chuàng)面的愈合。Wistar大鼠是醫(yī)學研究中使用最廣泛的實驗動物之一,本研究以Wistar大鼠為研究對象,比較分析不同條件下分離和培養(yǎng)的大鼠MSCs的生物學特性,并對其進行鑒定,以建立一種簡單、有效、經濟、實用的分離、培養(yǎng)MSCs的方法。將綠色熒光蛋白基因通過脂質體轉染MSCs,觀察其是否可應用于組織工程修復技術的細胞標記。 目的:應用不同方法分離和培養(yǎng)大鼠骨髓間充質干細胞,優(yōu)化MSCs的分離方法,尋找一種經濟、實

8、用而又簡便的分離和培養(yǎng)MSCs的方法,為深入研究MSCs創(chuàng)造條件。 方法:分別采用全骨髓法(直接貼壁法)、Percoll分離液(密度為1.073g/ml)及淋巴細胞分離液(密度為1.077g/ml)梯度離心法分離MSCs,分別通過不同的首次換液時間進行培養(yǎng),比較不同條件下分離和培養(yǎng)的貼壁細胞鋪滿整個培養(yǎng)瓶的底部所需時間及細胞生長特性、生長曲線和細胞貼壁率的差異,同時應用流式細胞儀檢測細胞周期和表面抗原CD44、CD90和CD45

9、的表達。 結果:采用全骨髓法分離的骨髓細胞,首次換液時間為72h、96h進行培養(yǎng)后,獲得的細胞數量多,細胞貼壁后增殖較為迅速,貼壁細胞鋪滿整個培養(yǎng)瓶的底部所需時間均為6~7d,原代細胞純度不高,但傳代后,可獲得純度較高的MSCs;用密度為1.073g/ml的Percoll分離液分離的骨髓細胞,首次換液時間為48h、72h、96h進行培養(yǎng)后,可獲得純度較高的MSCs,貼壁細胞鋪滿整個培養(yǎng)瓶的底部所需時間為13~21d;而應用密度為

10、1.077g/ml淋巴細胞分離液分離不能培養(yǎng)出梭形成纖維細胞樣貼壁生長的MSCs;首次換液時間過早很難獲得成纖維樣貼壁生長的MSCs。傳代后,細胞生長迅速,采用全骨髓法及Percoll分離液分離培養(yǎng)的細胞第1、2、3代之間生長曲線相似呈S型,在接種后的第1天、第2天為細胞的潛伏適應期,從第3天起細胞開始增殖并進入對數生長期,第6天左右細胞生長達頂點,以后進人平臺期,第8天時細胞數量有所減少。計算群體倍增時間:采用直接貼壁法分離培養(yǎng)的第1

11、、2、3代骨髓MSCs分別為30.2h、29.6h和29.2h,Percoll分離法分離培養(yǎng)的骨髓MSCs群體倍增時間分別是為29.8h、29.3 h和29.0h。兩種方法分離培養(yǎng)的傳代細胞第1、2、3代之間的生長速度,經方差分析P>0.05,還不能認為2種方法培養(yǎng)的細胞第l、2、3代細胞間的差異有統(tǒng)計學意義。 結論:本研究建立了體外分離純化、培養(yǎng)擴增大鼠骨髓MSCs的方法。應用全骨髓法首次換液時間不少于72h,應用密度為1.0

12、73g/ml的Percoll分離方法首次換液時間不少于48h,進行培養(yǎng)可獲得成纖維樣貼壁生長的MSCs。Percoll分離法可以更好的提高MSCs的純度,但培養(yǎng)周期較長;全骨髓法培養(yǎng)周期短,但純度較差,傳代后細胞純度得以提高。 第二部分 增強型綠色熒光蛋白基因轉染大鼠骨髓間充質干細胞及其穩(wěn)定表達和影響 目的:檢測增強型綠色熒光蛋白(EGFP)表達載體pEGFP-C1對大鼠骨髓間充質干細胞(MSCs)的轉染效率及其表達情況

13、和對細胞生長的影響。為利用pEGFP-C1轉染骨髓間充質干細胞提供依據。 方法:pEGFP-C1質粒經體外擴增、提取、純化后,經酶切鑒定;以全骨髓法分離培養(yǎng)大鼠骨髓間充質干細胞,取生長良好的第三代骨髓間充質干細胞;以脂質體介導法轉染pEGFP,應用熒光顯微鏡觀察轉染效率及熒光表達情況;通過G418篩選出抗性克隆,進行穩(wěn)定轉染,觀察熒光持續(xù)時間并檢測轉染細胞的生長曲線。 結果:綠色熒光蛋白在基因轉染24h后開始表達,pEG

14、FP轉染MSCs的效率為12%,經過G418篩選后形成抗性克隆,表達持續(xù)4周以上,但熒光逐漸減弱。轉染后的細胞生長較未轉染細胞慢(P

15、治療皮膚深Ⅱ度燙傷的機制。 方法:以全骨髓法分離培養(yǎng)雄性大鼠骨髓間充質干細胞,消化、重懸后分別通過尾靜脈注射、創(chuàng)面局部注射移植給深Ⅱ度燙傷的雌性大鼠。觀察創(chuàng)面變化、肉芽組織生長和創(chuàng)面愈合情況;并在傷后不同時間點取組織標本按常規(guī)方法作蘇木精-伊紅(HE)染色進行組織學觀察;取活檢組織石蠟切片按免疫試劑盒S-P法進行免疫組織化學染色檢測bFGF、PCNA,FAK、ERK和c-fos的表達情況。取不同時相點創(chuàng)傷組織和骨髓組織,提取基因

16、組DNA,通過PCR方法檢測創(chuàng)面皮膚組織和骨髓中移植供體鼠的Y染色體基因性別決定區(qū)(Sry)片段的表達。 結果:燙傷大鼠創(chuàng)面愈合天數:靜脈注射組為20.5±1.92d,局部注射組為21.3±2.05d,對照組為24.6±2.67d。靜脈注射組和局部注射組愈合速度與對照組相比,差異均具有顯著性(PO.05)。HE染色結果:治療組創(chuàng)面愈合質量均好于對照組。PCR檢

17、測結果表明,在治療組受體鼠的創(chuàng)面組織細胞有供體鼠Y染色體基因的表達;而且靜脈注射組骨髓組織中也檢測到了sry基因的表達。免疫組織化學染色顯示對照組燙傷后7d真皮深層血管內皮細胞PCNA表達++,14d呈強陽性+++,到21d、28d表達有所下降為++。治療組PCNA表達與對照組無明顯差異;對照組燙傷后7d血管內皮細胞FAK表達+,14d呈++,到21d、28d表達有所下降為+;靜脈注射組和局部注射組無明顯差異,燙傷后7d血管內皮細胞FA

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