甲狀旁腺激素對去勢大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特性影響的研究.pdf

1、研究背景：
　　絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥（postmenopausal osteoporosis，PMO），又被稱為Ⅰ型骨質(zhì)疏松，是一種與體內(nèi)雌激素水平缺乏有關(guān)的常見代謝性骨疾病。慢性牙周炎是PMO的常見伴發(fā)疾病，臨床上表現(xiàn)為進行性牙周附著喪失和牙槽骨吸收，這對口腔正畸、種植、修復(fù)等學(xué)科的治療有不同程度的影響。
　　骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞( bone marrow mesenchymal stem cells，BMMSCs)具有自我更新能

2、力以及多向分化潛能，在不同的體外誘導(dǎo)條件下，能夠分化為成骨細(xì)胞、成脂細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞等。因此，BMMSCs在骨組織代謝以及穩(wěn)態(tài)平衡中發(fā)揮重要作用。有學(xué)者認(rèn)為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞( bone marrow mesenchymal stem cells，BMMSCs)功能異常在PMO的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。骨質(zhì)疏松來源的BMMSCs增殖和成骨分化能力降低、但成脂能力升高，這與骨質(zhì)疏松狀態(tài)下骨髓腔中骨量減少脂肪量增加這一現(xiàn)象相符。
　

3、　甲狀旁腺激素( parathyroid hormone，PTH)是一種調(diào)節(jié)體內(nèi)骨代謝的重要激素，具有促進骨形成和骨吸收的雙重效應(yīng):大劑量持續(xù)給予PTH誘發(fā)骨吸收，小劑量間斷給予PTH刺激骨生成。但相關(guān)作用機制尚不十分明確，這影響了PTH治療骨質(zhì)疏松的臨床應(yīng)用。以往PTH調(diào)節(jié)骨代謝的研究大多關(guān)注的是成骨細(xì)胞，關(guān)于PTH對BMMSCs的生物學(xué)特性影響，我們知之甚少。
　　研究目的：
　　本研究擬觀察去勢大鼠體內(nèi)小劑量間斷注射P

4、TH后，骨髓微環(huán)境尤其是BMMSCs增殖分化等生物學(xué)特性的改變，從細(xì)胞水平揭示小劑量間斷PTH促進骨形成的相關(guān)機制，從而為其臨床應(yīng)用提供更多的實驗依據(jù)。
　　研究內(nèi)容：
　?。?）研究小劑量間斷PTH刺激對去勢大鼠骨量和骨組織形態(tài)的影響；
　?。?）研究小劑量間斷PTH刺激對去勢大鼠BMMSCs增殖凋亡特性的影響；
　?。?）研究小劑量間斷PTH刺激對去勢大鼠BMMSCs多向分化能力的影響。
　　研究方法：

5、
　?。?）通過卵巢切除法建立絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松大鼠模型，去勢術(shù)后6周開始皮下注射PTH1-34,持續(xù)5周。采用Micro-CT和組織染色相結(jié)合的方法對模型進行評估，并比較假手術(shù)組（Sham組）、去勢組（OVX組）和去勢后加PTH1-34組（OVX+PTH1-34組）的骨量和骨組織形態(tài)。
　?。?）采用全骨髓貼壁法分離培養(yǎng)Sham組、OVX組、OVX+PTH1-34組BMMSCs，并從細(xì)胞形態(tài)學(xué)和細(xì)胞免疫分子表型等方面對獲得的細(xì)

6、胞進行鑒定。
　　（3）通過流式細(xì)胞術(shù)、生長曲線、體外成骨成脂誘導(dǎo)分化實驗，比較三組BMMSCs的生物學(xué)特性。
　　研究結(jié)果：
　?。?）通過Micro-CT掃描和三維重建，發(fā)現(xiàn)OVX組較Sham組骨體積分?jǐn)?shù)（BV/TV）、骨小梁厚度（Tb.Th）、骨表面積/骨體積（BS/BV）明顯降低，同時骨組織HE染色可見OVX組大鼠骨小梁排列紊亂且數(shù)目減少，這提示骨質(zhì)疏松動物模型構(gòu)建成功。OVX加PTH1-34組骨體積分?jǐn)?shù)（BV

7、/TV）、骨小梁厚度（Tb.Th）、骨表面積/骨體積（BS/BV）明顯大于OVX組，同時骨組織HE染色顯示OVX加PTH1-34組大鼠骨小梁數(shù)目較OVX組增加，排列也較規(guī)整，進一步證實了PTH1-34的促骨形成作用。
　?。?）光學(xué)顯微鏡下可見三組BMMSCs均呈典型的紡錘形漩渦狀細(xì)胞形態(tài)，但OVX組較Sham組BMMSCs細(xì)胞體積略大且更圓，OVX加PTH1-34組BMMSCs細(xì)胞形態(tài)更接近Sham組。流式細(xì)胞儀分析三組實驗細(xì)胞

8、均表達正常間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志物，不表達造血系細(xì)胞標(biāo)志物，提示實驗獲取細(xì)胞是高純度BMMSCs。
　?。?）通過比較三組BMMSCs的生長曲線、S期細(xì)胞比例以及凋亡率發(fā)現(xiàn)，OVX加PTH1-34組BMMSCs的增殖能力較OVX組明顯增強，凋亡率明顯降低；三組BMMSCs成骨誘導(dǎo)后，ALP染色、茜素紅染色、鈣結(jié)節(jié)定量分析以及成骨相關(guān)基因檢測顯示，OVX加PTH1-34組BMMSCs成骨能力明顯高于OVX組；成脂誘導(dǎo)后，油性O(shè)染色以及