人骨髓間充質干細胞體外誘導分化及生物學特性探討.pdf

1、目的：在體外將人骨髓間充質干細胞(hMSCs)進行純化、擴增及向心肌樣細胞定向誘導分化，對誘導后的細胞進行心肌樣細胞相關特性分析并探討體外誘導人骨髓間充質干細胞(hMSCs)向心肌樣細胞分化過程中分化與凋亡的情況，檢測分化過程中心肌細胞特征表達及膜電位變化的情況，為hMSCs臨床移植治療提供實驗參考依據(jù)。 方法：(1)采用體外純化、擴增后的第4代hMSCs在體外經5μmol．l<'-1>5-雜氮胞苷誘導24小時后繼續(xù)培養(yǎng) 8 周

2、，相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化，免疫組化方法鑒定心肌特異性蛋白心房鈉尿肽(ANP)和連接蛋白(CX43)的表達，流式細胞儀檢測誘導前后細胞表面抗原(CD31、CD34、CD45、CD90)的表達情況，全細胞膜片鉗技術檢測不同時期細胞膜電位的變化。 (2)將純化、擴增后的第 4 代hMSCs，分3組在體外分別經0 μmol．l<'-1>、2.5 μmol．l<'-1>、5.0μmol．l<'-1> 5-azacytidine(5-

3、Aza)誘導24h后繼續(xù)培養(yǎng)8周，相差顯微鏡下觀察細胞形念變化，流式細胞儀檢測各組細胞周期及凋亡指數(shù)，應用RT-PCR技術分析肌球蛋白重鏈(β-MHC)、肌鈣蛋白T(CTNT)、凋亡相關基因(Bcl-2、Bax)的mRNA在分化過程中的動態(tài)表達。 結果：hMSCs誘導前為紡錘形，誘導后第2天部分細胞即開始發(fā)生形變，呈球形或短棒狀，1周后胞漿中顆粒增多，約20～30％細胞邊緣呈毛刷樣變化；hMSCs表面抗原CD31、CD34、CD

4、45在誘導前后差異無統(tǒng)計學意義，CD90未誘導時表達呈弱陽性，誘導后明顯增高(P<0.05)；ANP和CX43在誘導前無表達，誘導后第2周開始表達且表達隨時間逐漸增強，但CX43在誘導后第5周表達量開始降低。hMSCs誘導后凋亡指數(shù)隨誘導后培養(yǎng)時間增加，低濃度誘導組低于標準濃度誘導組，組問差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，G<,0>/G<,1>期細胞比例誘導后較對照組顯著減少(P<0.05)；β-MHC和CTNT基因分別在誘導后第1周和

5、第4周時表達開始增強，在第6周時均達到高峰，第8周時表達開始衰減，Bcl-2、Bax基因表達呈時間依賴性變化，hMSCs經誘導后隨心肌樣細胞特征的表達膜靜息電位、去極化幅值和去極化速率逐漸增高。 結論：(1)骨髓間充質干細胞在體外經純化、擴增和誘導后可表現(xiàn)心肌樣細胞的生物學特性，可為hMSCs臨床移植治療提供可靠的細胞來源；(2)體外誘導過程中hMSCs可發(fā)生細胞凋亡，采用2.5 μmol．l<'-1>5-Aza低濃度誘導可減少