北京油雞骨髓間充質(zhì)干細胞和胚胎生殖細胞重要生物學(xué)特性研究.pdf

1、本試驗對北京油雞胚胎生殖細胞和骨髓間充質(zhì)干細胞的分離、培養(yǎng)、生物學(xué)特性鑒定、外源基因?qū)爰罢T導(dǎo)分化進行了初步探索和研究,得出了以下結(jié)果:1.采用全血貼壁或密度梯度離心法分離30～60日齡雞脛骨的骨髓間充質(zhì)干細胞,經(jīng)篩選、擴增,在體外培養(yǎng)傳至第7代. 骨髓間充質(zhì)干細胞為貼壁生長,形態(tài)大多為紡錘形,少量多角形、圓形.細胞生長曲線呈"S"型,細胞群體倍增時間約36h.本試驗共凍存8個個體的骨髓間充質(zhì)干細胞,25支凍存管.凍存前、復(fù)蘇后

2、細胞活率分別為98﹪、87.5﹪.2.北京油雞骨髓間充質(zhì)干細胞核型分析統(tǒng)計結(jié)果二倍體染色體數(shù)目為2n=78±,符合北京油雞的種屬特性,遺傳性能穩(wěn)定;組織化學(xué)檢測糖原檢測呈陽性、堿性磷酸酶檢測呈陰性、蘇丹Ⅲ染色呈陰性,符合MSCs的組織化學(xué)特征;免疫熒光檢測顯示北京油雞MSCs表達細胞表面標志CD44、CD54、SSEA-4,不表達CD34、CD45、SSEA-1、c-kit,和其他物種的骨髓間充質(zhì)干細胞相似:微生物檢測結(jié)果均為陰性.3.

3、脂質(zhì)體介導(dǎo)pEGFP-Cl基因轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細胞,轉(zhuǎn)染后48h～96h陽性細胞明顯增多、強度增強,1周內(nèi)有較強表達,轉(zhuǎn)染率最高可達40﹪.4.體外培養(yǎng)雞骨髓間充質(zhì)干細胞在地塞米松、β-磷酸甘油、抗壞血酸誘導(dǎo)下,以及與骨組織共培養(yǎng)條件下,分化為成骨細胞,具有成骨細胞的形態(tài)特征,堿性磷酸酶活性提高,茜素紅、四環(huán)素標記檢測呈陽性.5.分離孵化5.5d雞胚生殖腺中的原始生殖細胞,原代與生殖腺細胞共培養(yǎng),繼代采川鼠胚成纖維細胞飼養(yǎng)層培養(yǎng),獲得的

4、胚胎生殖細胞克隆體外培養(yǎng)傳至第7代.北京油雞胚胎原始生殖細胞含大的細胞核和相對較少的胞質(zhì),核仁不明顯;胚胎生殖細胞克隆呈規(guī)則的島狀或其他集落狀生長,多層分布. 本實驗共凍存10個個體胚胎生殖細胞,30支凍存管.凍存前、復(fù)蘇后細胞活率分別為93.5﹪、74.7﹪.6.北京油雞胚胎生殖細胞經(jīng)染色體核型分析、細胞組織化學(xué)鑒定、免疫熒光檢測、微生物檢測,證明所培養(yǎng)細胞為胚胎生殖細胞,符合北京油雞的種屬特性,遺傳性能穩(wěn)定;培養(yǎng)物生長狀態(tài)良