Notch信號途徑在宮頸癌腫瘤發(fā)生中的作用及其機制的初步研究.pdf

1、宮頸癌是常見的婦科腫瘤之一，特別是在發(fā)展中國家更多見。近年來，其發(fā)病率和死亡率有所上升。感染高危型人乳頭狀瘤病毒(HPV)是本病發(fā)生過程中重要的危險因子，但這一關鍵因素在宮頸癌腫瘤發(fā)生中的作用機制尚未闡明。 從果蠅到人類，Notch途徑的遺傳特征高度保守；而在哺乳動物中，其構成尤為復雜。相鄰的細胞配體與受體相互作用導致Notch蛋白連續(xù)裂解，釋放出受體的胞內(nèi)段(ICN)。ICN轉(zhuǎn)入細胞核內(nèi)，使得CBF1/Su(H)/LAG1(C

2、SL)轉(zhuǎn)錄因子從一個抑制物轉(zhuǎn)變?yōu)檗D(zhuǎn)錄激活子。該信號途徑參與細胞的分化、增殖和凋亡，并影響許多器官的發(fā)育和功能。 Notch途徑的病理生理改變與腫瘤的發(fā)生相關。既往的研究表明，Notch受體和配體在正常的宮頸組織中有表達；并且在宮頸病變時，其表達有變化。因此，該信號途徑在正常宮頸的組織發(fā)生及其腫瘤生成的過程中發(fā)揮著關鍵作用。Notch途徑與宮頸癌的關系是一個新的研究領域。 有待于此，本實驗擬研究Notch途徑在宮頸癌腫瘤發(fā)

3、生中的作用及其機制。目前，得到的主要結果如下： 1.用半定量RT-PCR檢測30例宮頸癌組織及30例正常宮頸組織中Notch1mRNA的表達，結果顯示兩組的表達有差別，宮頸癌組織中的含量高。 提取各種宮頸病變細胞中的mRNA，并用RT-PCR檢測；其中的部分細胞檢測Notch1蛋白的表達。這些細胞包括含有HPV16DNA的SiHa、Caski和S12，以及含有HPV18DNA的HeLa；W12細胞含有游離型的HPV16D

4、NA；而C33a不含HPVDNA。結果顯示，本實驗檢測的整合有HPVDNA的細胞表達Notch1mRNA及其蛋白的水平較高。整合HPV16DNA的S12細胞表達高水平的Notch1蛋白；而無整合的W12細胞，其表達量低或無表達。這說明內(nèi)源性Notch1蛋白的表達水平與病毒DNA的整合相關。 本實驗研究Notch1蛋白在正常宮頸、宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變到宮頸癌組織中的表達和在細胞內(nèi)定位的變化。在30例正常宮頸組織中有22例未見到Not

5、ch1陽性染色；Notch1在30例CINⅠ-Ⅱ的表達僅為9例；在30例CINⅢ的表達為23例，主要定位于細胞漿及胞膜；在宮頸癌組織中的表達率為100％，多定位于細胞核中。Notch1的表達上調(diào)在宮頸癌腫瘤發(fā)生的過程中可能發(fā)揮著重要的作用。 2.為研究Notch途徑在宮頸癌細胞中的作用機制，構建并鑒定一種檢測細胞內(nèi)活化的Notch信號的報告基因質(zhì)粒pTP1-EGFP-N1；測序及鑒定后，與Notch1的胞內(nèi)段(ICN)共轉(zhuǎn)染宮頸

6、癌細胞后有陽性表達。 3.本實驗研究了宮頸癌的發(fā)生與Notch信號調(diào)控相關蛋白HPC2基因的關系。以宮頸癌組織和HeLa細胞基因組DNA為模板用PCR法擴增人HPC2基因片段，將此基因片段插入pGEM-Teasy載體，酶切鑒定并測序。Blast分析發(fā)現(xiàn)其C端一段保守序列具有多態(tài)性。該位點的改變可能與宮頸癌的發(fā)生有關。為進一步研究該基因在宮頸癌發(fā)生中的作用，構建了HPC2原核表達載體及真核表達載體。 4.利用脂質(zhì)體，分別將

7、含有Notch1(ICN)的質(zhì)粒pRAMIC及對照質(zhì)粒pEGFP-N1轉(zhuǎn)染入HeLa等宮頸癌細胞。結果顯示兩組均發(fā)出綠色熒光，且轉(zhuǎn)染后的細胞大小及外形無明顯變化；并進一步比較了轉(zhuǎn)染后Notch1的表達。穩(wěn)定表達ICN及EGFP的細胞用G418篩選，分別構建了HeLa-ICN/EGFP(HeLa-ICN)和HeLa-EGFP細胞。 5.本實驗研究了過表達Notch1(ICN)的宮頸癌細胞在細胞生長、增殖、凋亡及黏附力等方面的改變及

8、其分子機制。細胞的生長增殖用MTT、胸腺嘧啶脫氧核苷滲入法和克隆形成實驗檢測；流式細胞儀分析細胞周期及凋亡的情況；細胞凋亡還用熒光顯微鏡觀察計數(shù)；Westernblot分析相關蛋白的表達。結果顯示，過表達Notch1(ICN)可抑制宮頸癌細胞的生長；瞬時轉(zhuǎn)染Notch1(ICN)的HeLa細胞，其G1期的比率增加；細胞周期相關蛋白CyclinA、CyclinE和pRb的表達下降；p53和p21蛋白在穩(wěn)定表達的HeLa-ICN細胞中表達上

9、調(diào)，而在HeLa-EGFP細胞中未檢出。同時，抑制凋亡的BCL-2蛋白在HeLa-ICN細胞中亦未檢出。雖然Notch1途徑可能參與了宮頸癌的腫瘤發(fā)生，但外源性過表達Notch1(ICN)通過阻滯細胞周期和誘發(fā)細胞凋亡，抑制了宮頸癌細胞的生長增殖。另外，同質(zhì)性黏附率細胞計數(shù)亦減少。 6.本實驗用Northernblot和轉(zhuǎn)錄活性實驗檢測Notch1(ICN)的過表達與HPVE6/E7的關系。結果顯示：Notch1(ICN)的過表