上皮間質(zhì)化(EMT)在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中誘導腫瘤干細胞的作用及其機制研究.pdf

1、第一部分上皮間質(zhì)化(EMT)在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中誘導腫瘤干細胞的作用及其機制研究
　　研究背景與目的:高危型人乳頭瘤病毒(HPV)感染是宮頸癌發(fā)生的最主要致病因子,但研究已證實90％以上感染在無任何干預(yù)的情況下可自行抑制,僅5%~10%發(fā)展為持續(xù)感染,而僅持續(xù)感染與子宮頸癌的發(fā)生有關(guān)。因此,高危HPV是宮頸癌發(fā)生發(fā)展的必要因素而不是充分因素,也就是說宮頸癌的發(fā)生發(fā)展過程中除了HPV也有其他一些因素的參與,然而目前這方面的機制不是很清

2、楚。只有了解其發(fā)生機制,才有利于制定治療方案,阻斷癌變的發(fā)展,從根本上抑制宮頸癌的發(fā)生。上皮間質(zhì)化(EMT)和腫瘤干細胞學說是目前腫瘤發(fā)生發(fā)展機制中的主導學說。研究EMT的發(fā)生機制及其調(diào)節(jié)因素在腫瘤生長、逃逸、轉(zhuǎn)移中的作用,以及如何阻斷這一機制的發(fā)生,在腫瘤的診斷治療中有重要意義,勢必成為腫瘤研究的新熱點。Weinberg等最近發(fā)現(xiàn),發(fā)生EMT的乳腺癌細胞除獲得抗凋亡能力外,還產(chǎn)生了部分干細胞的特性,如自我更新等。EMT不僅使癌細胞從原

3、發(fā)腫瘤播散出去,也賦予了它們類似于干細胞的自我更新能力,為進一步研究腫瘤發(fā)生發(fā)展的機制提供新的思路。通過本研究我們想證實EMT對HPV感染宮頸上皮后惡性轉(zhuǎn)化過程中產(chǎn)生干細胞特性的細胞,進一步明確宮頸癌的發(fā)病機制,完善和補充人們對宮頸癌發(fā)病機制的認識;為早期防治宮頸癌的新策略尊定實驗和理論基礎(chǔ)。
　　材料方法：1.篩選、鑒定TGF-β1和TWIST誘導的EMT改變的Ect,End和Siha細胞系Ect、End、Siha細胞通過TGF

4、-β1誘導EMT改變。構(gòu)建pcDNA4.0-TWIST載體,并篩選出穩(wěn)定表達TWIST的End和Siha細胞。檢測誘導EMT前后細胞EMT相關(guān)標志物的表達變化。
　　2.研究EMT改變后宮頸上皮細胞具有干細胞特性分別在mRNA和蛋白水平上檢測TGF-β1和TWIST誘導所引起的EMT改變前后的Ect、End和Siha細胞干細胞相關(guān)標志物的表達變化。
　　3.宮頸癌干細胞的體外功能研究已經(jīng)EMT誘導的宮頸干細胞通過細胞球形成實

5、驗、ck10ck13的免疫熒光檢測實驗來證實干細胞的自我更新能力、多項分化潛能。
　　結(jié)果：1.EMT轉(zhuǎn)錄因子TGF-β1和TWIST在HPV永生化的宮頸上皮細胞和宮頸癌細胞中成功誘導出EMT改變。
　　2.TGF-β1和TWIST所發(fā)生的EMT改變在宮頸上皮細胞和宮頸癌細胞中誘導出具有干細胞特性細胞。
　　3.體外成功驗證在宮頸上皮細胞和宮頸癌細胞中EMT改變所誘導的干細胞特性具有自我更新能力、多項分化潛能。

6、　　結(jié)論：
　　EMT發(fā)生的關(guān)鍵因子TGF-β1和TWIST在體外HPV永生化的宮頸上皮細胞及宮頸癌細胞中可以誘導出具有自我更新能力、多項分化潛能的干細胞特性的細胞,從而參與了宮頸癌的發(fā)生發(fā)展。
　　第二部分卵巢癌耐藥相關(guān)基因的全基因組整合分析及相關(guān)信號通路分析
　　背景:癌癥基因組圖譜(TheCancerGenomeAtlas,TCGA)是由美國國立癌癥研究所(NCI)及國立人類基因組研究所(NHGRI)於2006年

7、啟動的大型研究。此計劃試圖通過應(yīng)用基因組分析技術(shù),特別是采用大規(guī)模的基因組測序,將人類全部癌癥(近期目標為50種包括亞型在內(nèi)的腫瘤)的基因組變異圖譜繪制出來,并進行系統(tǒng)分析,旨在找到所有致癌和抑癌基因的微小變異,了解癌細胞發(fā)生、發(fā)展的機制,在此基礎(chǔ)上取得新的診斷和治療方法,最后可以勾畫出整個新型“預(yù)防癌癥的策略”。前期一些卵巢癌研究因為樣本量太小,很少有化療耐藥相關(guān)報道基因的重疊。最近,TCGA研究網(wǎng)絡(luò)獲得了卵巢癌基因組改變的全面圖譜并

8、把數(shù)據(jù)向公眾開放。TCGA數(shù)據(jù)庫具有超大的樣本量,全面的分子特征及臨床預(yù)后信息。因此,在這項研究中,我們使用了TCGA大樣本量卵巢癌患者數(shù)據(jù)來整合分析拷貝數(shù)變異和基因表達改變與漿液性卵巢癌化療耐藥的相關(guān)性。
　　方法和結(jié)果:TCGA卵巢癌數(shù)據(jù)庫的569個腫瘤樣本的基因表達和拷貝數(shù)變異數(shù)據(jù)以用半監(jiān)督聚類分析方法結(jié)合一種新的打分函數(shù)來分析。然后建一個基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進一步查明負責化療耐藥組和化療敏感組之間的差異表達基因的拷貝數(shù)變異的基因。

9、我們已經(jīng)確定了在化療耐藥組中有460個基因的重大缺失或擴增。通過與基因表達數(shù)據(jù)整合分析,我們預(yù)測94個基因的拷貝數(shù)改變同時與基因表達相關(guān)。其中,13個重要的基因和六個關(guān)鍵信號通路在化療反應(yīng)中具有重要的意義。此外,13個潛在的血清標志物被認為可能預(yù)測漿液性卵巢癌的化療耐藥性。
　　結(jié)論:在大量樣本中所發(fā)現(xiàn)的基因特征更準確的預(yù)測漿液性卵巢癌的化療反應(yīng)?？截悢?shù)變異和基因表達的整合分析有助于理解化療耐藥性的潛在機制。
　　第三部分腺

10、相關(guān)病毒介導的LIGHT對小鼠宮頸癌模型的治療作用研究
　　目的：構(gòu)建含腫瘤壞死因子超家族成員14(LIGHT)的重組腺相關(guān)病毒(rAAV-LIGHT),探討(rAAV-LIGHT)對TC-1細胞株所建立的小鼠宮頸癌模型的抑瘤效應(yīng)的可行性。方法：用基因重組方法構(gòu)建含LIGHT全長的重組腺相關(guān)病毒骨架質(zhì)粒pAAV-IRES-LIGHT-hrGFP,磷酸鈣沉淀法將腺相關(guān)病毒載體系統(tǒng)共轉(zhuǎn)染入病毒包裝細胞中,分別合成rAAV-LIGHT和

11、rAAV-GFP。并用實時熒光定量PCR測病毒滴度。RT-PCR檢測rAAV-LIGHT對TC-1細胞的轉(zhuǎn)染效率。體外用淋巴毒性試驗來檢測LIGHT的免疫效應(yīng)。小鼠細胞系TC-1(轉(zhuǎn)染過E6E7RAS)用于建立小鼠宮頸癌模型。成瘤第3天對空白對照組(5只小鼠),rAAV-GFP(5只小鼠),rAAV-LIGHT(5只小鼠)組分別進行肌肉注射。觀察其生物特性及用實時定量PCR檢測腫瘤微環(huán)境中LIGHT和其他細胞因子的表達情況。觀察rAAV

12、-LIGHT的抑瘤效應(yīng)。通過流式細胞儀和腫瘤組織H&E染色、免疫組化檢測小鼠淋巴細胞增值效應(yīng)。結(jié)果：成功構(gòu)建并鑒定了rAAV-LIGHT和rAAV-GFP,滴度為2.5×1010v.g/ml,轉(zhuǎn)染效率為60%。SPSS13.0分析結(jié)果顯示rAAV-LIGHT組腫瘤大小明顯小于對照組及rAAV-GFP組(P=0.0055,P=0.029P<0.05)。對照組及rAAV-GFP組比較無明顯統(tǒng)計學意義(P=0.115P>0.05)。結(jié)論：rA