胎盤生長(zhǎng)因子調(diào)控上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化在宮頸癌轉(zhuǎn)移中的作用研究.pdf

1、目的：
　　通過(guò)檢測(cè)PLGF及其受體Flt-1及EMT相關(guān)蛋白E-cadherin、vimentin在宮頸癌及癌旁正常宮頸組織中的表達(dá)特點(diǎn)，分析研究各蛋白表達(dá)與宮頸癌分期、分級(jí)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間的相關(guān)性;同時(shí)，檢測(cè)了宮頸癌患者血清及陰道盥洗液中PLGF的表達(dá)水平與宮頸癌分期及HPV感染狀態(tài)之間的相關(guān)性。采用培養(yǎng)的宮頸癌siha細(xì)胞系，研究PLGF對(duì)宮頸癌細(xì)胞的促遷移作用及對(duì)EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)調(diào)控作用及其可能機(jī)制。為進(jìn)一步了解宮頸癌

2、浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移機(jī)制，開(kāi)發(fā)新的宮頸癌篩查手段及治療策略提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：
　　1.采用HE染色技術(shù)，確認(rèn)所收集的組織標(biāo)本取材的準(zhǔn)確性，對(duì)所取得的準(zhǔn)確的標(biāo)本納入后續(xù)的研究。
　　2.采用免疫組織化學(xué)染色技術(shù)，檢測(cè)PLGF、受體Flt-1及EMT相關(guān)蛋白E-cadherin及vimentin，在宮頸癌及癌旁組織的表達(dá)情況，并分析它們之間的相關(guān)性。
　　3.采用western blot技術(shù)進(jìn)一步檢測(cè)宮頸癌及癌旁正常組織

3、中，PLGF、受體Flt-1及EMT相關(guān)蛋白E-cadherin及vimentin，在宮頸癌及癌旁組織的表達(dá)情況。
　　4.采用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)法檢測(cè)宮頸癌患者及正常對(duì)照人群血清及陰道盥洗液中，分析PLGF的表達(dá)水平與HPV感染狀態(tài)及腫瘤分期之間的關(guān)系。
　　5.采用體外培養(yǎng)的宮頸癌siha細(xì)胞系，應(yīng)用transwell法，分析研究PLGF刺激對(duì)宮頸癌細(xì)胞遷移作用。
　　6.采用western blot方

4、法，分析PLGF處理后的siha細(xì)胞中，EMT相關(guān)蛋白表達(dá)的變化。
　　7.采用shRNA-Flt-1慢病毒載體感染siha細(xì)胞，用嘌呤霉素篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)shRNA-Flt-1的細(xì)胞株。
　　8.采用正常培養(yǎng)的siha細(xì)胞及穩(wěn)定沉默F(xiàn)lt-1的siha細(xì)胞，并應(yīng)用transwell法及western blot技術(shù)，分析研究敲除Flt-1后，PLGF對(duì)siha細(xì)胞促進(jìn)遷移作用及EMT相關(guān)蛋白表達(dá)情況的影響。
　　9.采

5、用培養(yǎng)的正常siha細(xì)胞，預(yù)先給予ERK/MAPK信號(hào)通路抑制劑處理后，采用transwell及western blot技術(shù)，觀察分析ERK/MAPK信號(hào)被抑制后，PLGF對(duì)siha細(xì)胞促進(jìn)遷移作用及EMT相關(guān)蛋白表達(dá)情況的影響。
　　結(jié)果：
　　1.在110例宮頸癌組織標(biāo)本中，PLGF及其受體Flt-1的表達(dá)明顯高于對(duì)應(yīng)的癌旁對(duì)照組織，它們表達(dá)的陽(yáng)性率分別為61.8％和60.9％;而E-cadherin的表達(dá)明顯降低占61

6、.8％，vimentin呈高表達(dá)陽(yáng)性率為59.1％。相關(guān)性分析表明，PLGF及Flt-1在宮頸癌組織中的高表達(dá)與E-cadherin的低表達(dá)及Vimentin的表達(dá)上調(diào)密切相關(guān)(P＜0.01，r=-0.618; P＜0.01，r=0.450); Western blot檢測(cè)進(jìn)一步證實(shí)，PLGF、Flt-1及vimentin在宮頸癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁對(duì)照組織，而E-cadherin的表達(dá)則明顯低于癌旁組織。
　　2.宮頸癌患者

7、血清PLGF的水平明顯高于正常對(duì)照組（22.96±0.90ng/ml VS9.926±1.049ng/m，P＜0.001），且隨著腫瘤分期的進(jìn)展而升高(P＜0.001);在陰道盥洗液中，患者PLGF的表達(dá)水平也明顯高于對(duì)照組（24.80±0.73ng/ml VS11.29±0.90ng/ml，P＜0.001）;而血清及陰道盥洗液之間或?qū)m頸癌Ⅰ期和Ⅱ期患者之間，PLGF的表達(dá)無(wú)明顯差異(P＞0.05)。
　　3.HPV感染陽(yáng)性患者陰

8、道盥洗液中PLGF的表達(dá)水平明顯高于HPV感染陰性組(25.74±0.6258ng/ml VS11.40±0.7439ng/ml, P＜0.05)。
　　4.體外實(shí)驗(yàn)證實(shí):PLGF處理后的siha細(xì)胞的遷移率明顯上調(diào)，而采用shRNA-Flt-1沉默F(xiàn)lt-1的表達(dá)后，可以明顯下調(diào)siha細(xì)胞的遷移(P＜0.05)，同時(shí)，PLGF可以明顯下調(diào)E-cadherin的表達(dá)并上調(diào)Vimentin的表達(dá)，但沉默F(xiàn)lt-1的表達(dá)后，可以逆轉(zhuǎn)

9、上述蛋白的表達(dá)。
　　5.ERK/MAPK信號(hào)通路抑制劑PD98059處理siha細(xì)胞后，能夠明顯抑制PLGF對(duì)siha細(xì)胞的促進(jìn)遷移作用，并能夠抑制PLGF對(duì)siha細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白的調(diào)控作用。
　　結(jié)論：
　　1.PLGF及其受體Flt-1在宮頸癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁對(duì)照組織，且與EMT相關(guān)蛋白E-cadherin在宮頸癌組織的低表達(dá)及vimentin的高表達(dá)密切相關(guān)，提示PLGF可能通過(guò)調(diào)控EMT相關(guān)蛋白的

10、表達(dá)，發(fā)揮促進(jìn)宮頸癌的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移的作用，因此，追蹤PLGF的表達(dá)變化有可能為預(yù)測(cè)腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)提供預(yù)警。
　　2.PLGF在宮頸癌患者血清及陰道盥洗液中的含量明顯高于正常對(duì)照組，且與宮頸癌分期密切相關(guān);而HPV感染患者陰道盥洗液中PLGF的表達(dá)水平明顯高于HPV陰性人群，提示HPV感染可能是促進(jìn)PLGF表達(dá)升高的重要因素，因此，動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)陰道分泌物中PLGF的表達(dá)變化，可能為HPV感染導(dǎo)致宮頸癌提供佐證，而PLGF有可能成為新的宮頸癌