RhoCGTP酶對(duì)宮頸癌侵襲轉(zhuǎn)移的影響以及與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的相互調(diào)控機(jī)制.pdf

1、宮頸癌是婦科最常見(jiàn)的惡性腫瘤，發(fā)病率在我國(guó)婦科惡性腫瘤中居首位。宮頸癌的轉(zhuǎn)移是影響患者預(yù)后的重要因素。腫瘤的惡性進(jìn)展涉及到細(xì)胞的異常增殖與凋亡，對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的粘附、侵襲以及遷移等過(guò)程。Rho GTP酶是一組鳥(niǎo)核苷酸調(diào)節(jié)蛋白，其介導(dǎo)的細(xì)胞運(yùn)動(dòng)可能在惡性腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，RhoC與Rho家族其它成員相比，與其下游效應(yīng)蛋白R(shí)OCK有更強(qiáng)的結(jié)合力，因而認(rèn)為RhoC對(duì)細(xì)胞骨架介導(dǎo)的細(xì)胞運(yùn)動(dòng)具有更強(qiáng)的調(diào)節(jié)能力。RhoC

2、的作用可能貫穿于腫瘤轉(zhuǎn)移的全過(guò)程，是腫瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程中的一個(gè)重要“開(kāi)關(guān)”基因，值得深入研究。此外，在腫瘤細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程中也發(fā)現(xiàn)有細(xì)胞骨架的改變，同時(shí)伴隨著上皮細(xì)胞標(biāo)記性蛋白E-cadherin的表達(dá)下降，而細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記性蛋白Vimentin，細(xì)胞具有更強(qiáng)的遷移和侵襲能力。宮頸癌來(lái)源于上皮組織，有研究證實(shí)E-cadherin表達(dá)減少與宮頸癌的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。從而推測(cè)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化在宮頸癌的轉(zhuǎn)移中起一定作用。由于EMT的表現(xiàn)與Rh

3、oC效應(yīng)的諸多相似性，這種相似性是因?yàn)閮烧咧g具有一定的關(guān)聯(lián)，還是彼此獨(dú)立，值得進(jìn)一步研究。 目的： 1.在組織學(xué)水平探討RhoGTP酶與宮頸癌惡性進(jìn)展的關(guān)系。 2.在細(xì)胞水平和分子水平,比較RhoC在不同宮頸癌細(xì)胞株中的表達(dá)，分析表達(dá)差異與粘附、侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)系。采用RNA干擾技術(shù)對(duì)RhoC進(jìn)行沉默，研究RhoC對(duì)人宮頸癌SiHa細(xì)胞增殖、凋亡、粘附、侵襲等轉(zhuǎn)移相關(guān)生物學(xué)行為的影響。體外模擬腫瘤惡性進(jìn)展中，細(xì)胞

4、表型轉(zhuǎn)換過(guò)程，即上皮－間質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程，分析RhoC在此過(guò)程中的表達(dá)及活性的變化，并探討沉默RhoC對(duì)該過(guò)程的影響。 方法： 1．研究RhoC在宮頸癌組織和細(xì)胞株中的表達(dá)。利用免疫組化方法和半定量RTPCR方法檢測(cè)正常宮頸組織、CIN組織和宮頸癌組織以及宮頸癌SiHa、HeLa和C33a細(xì)胞株RhoC蛋白和mRNA的表達(dá)，利用體外基質(zhì)膠粘附實(shí)驗(yàn)、Transwell體外侵襲實(shí)驗(yàn)和遷移實(shí)驗(yàn)比較不同細(xì)胞之間粘附率、侵襲能力和遷移能

5、力的差異，初步研究RhoC的表達(dá)水平與宮頸癌惡性進(jìn)展以及與細(xì)胞體外粘附、侵襲和遷移能力的關(guān)系。 2．研究RhoC對(duì)宮頸癌SiHa細(xì)胞增殖、凋亡和侵襲能力的影響。將RhoC siRNA轉(zhuǎn)入SiHa細(xì)胞中，在RhoC基因沉默前后，分別用MTT細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖活性，Annexin V-PI染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，體外基質(zhì)膠粘附實(shí)驗(yàn)、Transwell體外侵襲實(shí)驗(yàn)和遷移實(shí)驗(yàn)比較細(xì)胞粘附率、侵襲能力和遷移能力的改變。 3.分析

6、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）對(duì)RhoC表達(dá)及活性的調(diào)控作用以及RhoC表達(dá)下調(diào)對(duì)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響。利用TGFβ1體外誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞株SiHa發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，以上皮表型的標(biāo)志蛋白E-cadherin和間質(zhì)表型的標(biāo)志蛋白Vimentin免疫熒光染色和western blot方法檢測(cè)的蛋白含量作為監(jiān)測(cè)EMT的指標(biāo)。Western blot和Pull down實(shí)驗(yàn)檢測(cè)EMT前后RhoC表達(dá)和活性的改變，同時(shí)利用體外侵襲實(shí)驗(yàn)比較SiHa細(xì)胞侵襲能力

7、的變化。在TGFβ1刺激細(xì)胞前后，分別在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)入RhoC siRNA，western blot檢測(cè)E-cadherin和Vimentin的表達(dá)變化，觀察EMT進(jìn)程的變化。 結(jié)果： 1.RhoC在正常宮頸組織、CIN組織和宮頸癌組織中的表達(dá)逐漸增高，在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的宮頸癌組織中的表達(dá)明顯高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織。在SiHa細(xì)胞和HeLa細(xì)胞中的表達(dá)明顯高于C33a細(xì)胞，前兩者的粘附率、侵襲能力和遷移能力明顯高于后者，而在Si

8、Ha細(xì)胞和HeLa細(xì)胞之間，以上指標(biāo)均沒(méi)有明顯差異。 2.RhoC的沉默可以明顯降低SiHa細(xì)胞的體外粘附能力和侵襲、遷移能力，但對(duì)SiHa的增殖和凋亡沒(méi)有明顯影響。 3.在TGFβ1誘導(dǎo)的EMT過(guò)程中，SiHa細(xì)胞的侵襲能力明顯增強(qiáng)，同時(shí)，RhoC的蛋白表達(dá)及活性明顯增強(qiáng)，沉默RhoC可明顯降低SiHa細(xì)胞的侵襲力，EMT通過(guò)提高RhoC的表達(dá)及活性增強(qiáng)細(xì)胞侵襲能力。抑制RhoC的表達(dá)可以阻滯EMT過(guò)程，但不能逆轉(zhuǎn)EMT