白藜蘆醇對宮頸癌侵襲的影響及其分子機制的研究.pdf

1、一.目的
　　 宮頸癌是婦科最常見的惡性腫瘤之一,在全球婦女中,宮頸癌的發(fā)病率僅次于乳腺癌居第二位,嚴重威脅廣大婦女的生命健康。據(jù)保守估計,全球每年約新增加50萬例臨床確診的宮頸癌病例,其中大部分發(fā)生在發(fā)展中國家。我國每年新增宮頸癌患者約13萬,每年約有5萬人死于宮頸癌。近年來我國宮頸癌的發(fā)病率明顯上升,且發(fā)病年齡逐漸年輕化,呈雙峰狀分布,即35-39歲和60-69歲[1]。宮頸癌的主要特點是局部蔓延,早期的侵襲轉移往往使患者錯

2、過了最佳的手術時機。因此,尋找一種抗宮頸癌侵襲的藥物將成為成功治療宮頸癌的關鍵。
　　 白藜蘆醇是一種多酚化合物,是植物在惡劣環(huán)境下或遭到病原體侵害時自身分泌的一種植物抗毒素[2]。研究表明[2],白藜蘆醇具有抗炎、抗氧化、抗動脈粥樣硬化、雌激素樣、免疫調節(jié)等多種生物學功能,在腫瘤的啟動、發(fā)生和發(fā)展三個階段均發(fā)揮強大的抗腫瘤作用[3]。其主要活性表現(xiàn)為:1)抑制細胞色素酶:細胞色素P450能夠通過氧化作用使某些致癌物質如BaP轉

3、變?yōu)楦叨戎峦蛔冄苌锊⑨尫抛杂苫?導致DNA氧化損傷。白藜蘆醇是細胞色素P450抑制劑,可阻止這一過程的發(fā)生[4];2)誘導谷胱甘肽-S-轉移酶、尿嘧啶-雙磷酸葡萄糖酸基轉移酶等解毒酶活性,使致癌物解[5]；3)抑制環(huán)氧合酶(COX):白藜蘆醇可通過阻礙核轉錄因子NF-Kb的活化抑制COX表達,從而抑制環(huán)氧合酶活性[6]；4)抑制蛋白激酶活性:酪氨酸蛋白激酶(PTK)能激活ATP末端磷酸,使底物蛋白質的酪氨酸殘基磷酸化,這一過程在腫瘤基

4、因表達的信息傳遞中起重要作用,許多惡性腫瘤細胞都發(fā)現(xiàn)有某種特定的PTK被激活或過量表達。白藜蘆醇可通過非競爭性結合機制抑制PKC的活性從而達到抗腫瘤的作用[7-8]。近年來,白藜蘆醇在防治腫瘤方面顯示出巨大的潛力,其作用機制的研究逐漸得到關注。然而,目前的研究多集中于白藜蘆醇對腫瘤細胞增殖的影響,對腫瘤細胞侵襲的影響及其作用機制知之甚少。關于白藜蘆醇對宮頸癌細胞侵襲轉移作用的研究目前尚屬空白。開發(fā)白藜蘆醇的抗宮頸癌作用,為宮頸癌的生物學

5、治療提供更多一種可供選擇的藥物,是一項有價值的工作。
　　 本研究將白藜蘆醇作用于體外培養(yǎng)的宮頸癌HeLa細胞及HeLa細胞荷瘤鼠模型,觀察其對宮頸癌細胞侵襲的影響,探討作用機制,摸索合理的用藥濃度,為白藜蘆醇在臨床上的應用提供實驗依據(jù)。
　　 二.實驗材料及方法
　　 第一部分:首先應用不同濃度的白藜蘆醇作用于宮頸癌HeLa細胞,采用MTT法檢測白藜蘆醇對細胞生長的影響,計算出藥物的半量抑制濃度(IC50)。根

6、據(jù)藥物對細胞生長的抑制情況聯(lián)合藥物的IC50值,我們將對細胞增殖影響較小的藥物濃度作為后續(xù)檢測白藜蘆醇對宮頸癌細胞侵襲轉移影響的實驗藥物濃度。白藜蘆醇處理HeLa細胞24h后,transwell侵襲實驗檢測宮頸癌細胞侵襲能力的改變情況；逆轉錄PCR(RT-PCR)、Western blot及酶譜法分別檢測與腫瘤細胞侵襲密切相關的基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMP)-2、-9,基質金屬蛋白酶組織抑制

7、劑(tissue inhibitor of metalloproteinases,TIMP)-1、-2 mRNA、蚩自及酶表達活性的改變情況,計算MMP-2/TIMP-1、MMP-9/TIMP-2值,探討基質金屬蛋白酶與其組織抑制劑之間的平衡與宮頸癌侵襲之間的關系；掃描電鏡觀察白藜蘆醇對宮頸癌HeLa細胞板狀偽足的影響,逆轉錄PCR(RT-PCR)及Westernblot檢測誘導板狀偽足產(chǎn)生的表皮生長因子(Epidermal Growt

8、h Factor,EGF)基因及蛋白表達水平;同時采用逆轉錄PCR(RT-PCR)及Western blot檢測維持腫瘤細胞自穩(wěn)狀態(tài)的鉀氯共轉運載體(K-Cl cotransport carrier,KCC)的基因及蛋白表達水平,為白藜蘆醇在臨床上的應用提供實驗依據(jù)。
　　 第二部分:應用雙熒光素酶基因報告實驗,研究白藜蘆醇對宮頸癌HeLa細胞過氧化物酶體增殖物激活受體γ(Peroxisome proliferators-act

9、ivated receptor,PPARγ)活性的影響。逆轉錄PCR(RT-PCR)及Western blot法檢測白藜蘆醇對宮頸癌細胞PPARγ表達水平的影響。進一步應用逆轉錄PCR(RT-PCR)及Westernblot法檢測應用PPARγ拮抗劑預處理后的宮頸癌細胞信號轉錄因子及活化子3(Signal transducer and activator of transcription,STATs)、細胞外基質金屬蛋白酶誘導因子(Ec

10、to-matrix metalloproteinases inducing factor,EMMPRIN)及MMP基因及蛋白的表達水平,探討PPARγ依賴的JAK-STAT3信號轉導通路在白藜蘆醇抑制MMP表達及活性中的作用。
　　 第三部分:構建宮頸癌HeLa細胞荷瘤鼠模型,采用腹腔給藥的方法每日注射不同濃度的白藜蘆醇。觀察荷瘤鼠的一般狀態(tài)及腫瘤的生長情況。逆轉錄PCR(RT-PCR)及Western blot法分別檢測瘤組織

11、MMP-2、MMP-9 mRNA及蛋白表達的改變情況。免疫組化方法檢測瘤組織微血管形成情況,了解白藜蘆醇在體內(nèi)對宮頸癌的影響。同時留取荷瘤鼠眼眶靜脈血,應用ELISA方法進行肝腎功能檢測,評價白藜蘆醇在體內(nèi)的藥物毒性。
　　 三.結果
　　 第一部分:MTT法檢測白藜蘆醇對細胞的生長抑制情況,結果表明,白藜蘆醇的半量抑制濃度(IC50)為0.8638mmol/L。濃度為0.25mmol/L、0.5mmol/L、1mmol

12、/L的白藜蘆醇對宮頸癌HeLa細胞的生長抑制率分別為27.78％、45.89％、55.13％。聯(lián)合分析細胞生長的抑制情況及藥物的IC50值,我們將后續(xù)檢測白藜蘆醇對宮頸癌細胞侵襲影響的實驗藥物濃度確定為0.25mmol/L、0.5mmol/L、1mmol/L。采用上述三個濃度的白藜蘆醇處理細胞24h后,檢測HeLa細胞侵襲能力,結果表明,白藜蘆醇能夠以劑量依賴的方式抑制宮頸癌HeLa細胞的侵襲。進一步對白藜蘆醇抑制宮頸癌細胞侵襲能力的作

13、用機制進行探討,發(fā)現(xiàn)隨著白藜蘆醇劑量的增加,腫瘤細胞侵襲轉移所必備的細胞裝配--細胞板狀偽足的質量明顯降低,誘導板狀偽足生成的EGF基因及蛋白的表達水平亦明顯減少；研究同時發(fā)現(xiàn),白藜蘆醇能夠以劑量依賴的方式抑制宮頸癌HeLa細胞MMP-2、MMP-9基因、蛋白的表達水平及酶活性,提高TIMP-1、TIMP-2基因、蛋白的表達水平及酶活性,降低MMP/TIMP值,恢復兩者之間的平衡關系；與此同時,白藜蘆醇能夠抑制腫瘤細胞KCC-1 mRN

14、A及蛋白的表達水平,破壞腫瘤細胞自穩(wěn)狀態(tài)的維持,降低宮頸癌細胞的侵襲能力。
　　 第二部分:研究表明,白藜蘆醇能夠以劑量依賴的方式提高PPARγ的活性及表達水平。研究同時發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇對STAT3基因及蛋白表達無明顯影響,但能夠以劑量依賴的方式抑制STAT3蛋白磷酸化,同時抑制EMMPRIN和MMP基因及蛋白的表達水平。應用RT-PCR及Western blot法檢測PPARγ拮抗劑(GW9662)預處理后的宮頸癌細胞STAT3、

15、EMMPRIN及MMP基因及蛋白的表達水平,結果表明抑制PPARγ活性后,白藜蘆醇對HeLa細胞STAT3蛋白磷酸化及EMMPRIN、MMP基因及蛋白表達的抑制作用消失。
　　 第三部分:成功構建宮頸癌HeLa細胞荷瘤鼠模型,采用腹腔給藥的方法每日注射不同濃度的白藜蘆醇。結果表明,白藜蘆醇能夠以劑量依賴的方式抑制荷瘤鼠模型腫瘤生長。結果同時表明,隨著白藜蘆醇劑量的增加MMP-2、MMP-9mRNA及蛋白表達水平降低,瘤組織微血管

16、的形成明顯減少。與此同時,白藜蘆醇對機體的肝腎功能沒有明顯的影響。
　　 四.結論
　　 第一部分:(1)白藜蘆醇能夠以劑量依賴的方式抑制宮頸癌HeLa細胞的侵襲能力；(2)白藜蘆醇能夠明顯抑制宮頸癌細胞MMP-2、MMP-9的表達及活性,提高TIMP-1、TIMP-2表達及活性,降低MMP/TIMP值,恢復兩者之間的平衡關系,降低MMP對細胞外基質的降解能力；(4)白藜蘆醇能夠抑制由EGF誘導的腫瘤細胞板狀偽足的形成；

17、(5)白藜蘆醇作用后,維持細胞自穩(wěn)狀態(tài)的KCC1基因及蛋白的表達水平明顯下降,有效抑制宮頸癌細胞的侵襲轉移。
　　 第二部分:(1)白藜蘆醇能夠明顯提高宮頸癌HeLa細胞PPARγ的表達及活性；(2)白藜蘆醇能夠通過PPARγ依賴的JAK-STAT3信號轉導通路影響MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2的表達及活性。
　　 第三部分:(1)白藜蘆醇能夠在體內(nèi)明顯抑制宮頸腫瘤的生長；(2)在體內(nèi)白藜蘆醇能夠明顯