HPV通過轉(zhuǎn)化生長因子信號(hào)通路致宮頸癌上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的研究.pdf

1、目的:
　　 宮頸癌(cervicalcancer，CC)是女性常見的惡性腫瘤，位居女性生殖器官惡性腫瘤的首位，是全球最主要的癌癥之一。目前研究認(rèn)為人乳頭瘤病毒（humanpapilomavirus，HPV）感染特別是高危型別的持續(xù)性感染，是引起子宮頸癌前病變和宮頸癌的基本原因。
　　 HPV為乳頭多瘤空泡病毒科的A亞群，是一類具有高度宿主特異性和親和力、無包膜的、小的雙鏈環(huán)狀DNA病毒，由核心和蛋白衣殼(L1和L2)組

2、成。其基因組中含有8個(gè)開放閱讀框架和1個(gè)上游調(diào)節(jié)區(qū)，其中E2、E6和E7三個(gè)開放閱讀框架為病毒癌基因。目前已發(fā)現(xiàn)120余種HPV亞型，分子流行病學(xué)發(fā)現(xiàn)超過2/3的宮頸癌標(biāo)本被檢測出HPV16或18陽性。其DNA可以隨機(jī)整合到宿主基因組并表達(dá)E6、E7癌基因并使宿主細(xì)胞永生化，E6、E7基因可以分別表達(dá)E6、E7蛋白，其蛋白可以分別和抑癌蛋白p53和視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤抑制蛋白(Retinoblastomatumorsuppressorprot

3、ain，pRB)結(jié)合，阻遏其抑癌功能，進(jìn)而促進(jìn)癌癥的發(fā)生發(fā)展。
　　 上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymaltransition，EMT）是指在某些生理或病理狀態(tài)下，上皮細(xì)胞失去極性，轉(zhuǎn)換成具有活動(dòng)能力、能夠在細(xì)胞基質(zhì)間自由移動(dòng)的間質(zhì)細(xì)胞的過程。它在胚胎形成和組織的形態(tài)發(fā)生過程中是一個(gè)基本的生理過程，特別是中胚層、神經(jīng)脊、鄂等的發(fā)育。但近來的研究發(fā)現(xiàn)EMT與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移有著密切的相關(guān)性。目前大

4、量的研究關(guān)注于EMT與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系。在誘導(dǎo)EMT發(fā)生的眾多細(xì)胞因子和轉(zhuǎn)錄因子中，轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforminggrowthfactor-β，TGF-β)被證實(shí)是誘導(dǎo)EMT的關(guān)鍵因子。
　　 目前已有大量有關(guān)TGF-β參與腫瘤EMT的報(bào)道，在宮頸癌中是否也存在這種現(xiàn)象，其與HPV在導(dǎo)致宮頸癌發(fā)生發(fā)展過程中的關(guān)系如何，仍有待研究。
　　 方法:
　　 ①體外培養(yǎng)HPV16陽性的鱗癌(SiHa)和HP

5、V18陽性的腺癌(HeLa)細(xì)胞系，分別設(shè)計(jì)針對(duì)HPV16E7的MiRNA干擾載體12MR0018C-1、12MR0018C-2、12MR0018C-3和12MR0018C-4(簡稱16E7-MiR-1、16E7-MiR-2、16E7-MiR-3和16E7-MiR-4)和針對(duì)HPV18E7的MiRNA干擾載12MR0018D-1、12MR0018D-2、12MR0018D-3和12MR0018D-4（簡稱18E7-MiR-1、18E7-

6、MiR-2、18E7-MiR-3和18E7-MiR-4），采用脂質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染方法分別轉(zhuǎn)染針對(duì)HPV16和HPV18E7基因的質(zhì)粒，Real-timePCR方法檢測轉(zhuǎn)染前后E7基因的表達(dá)差異以沉默效率較高的質(zhì)粒進(jìn)行后續(xù)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染;
　　 ②將前期課題組使用的針對(duì)HPV16E6和HPV18E6的stealthRNA轉(zhuǎn)換成MiRNA，并構(gòu)建到pcDNA6.2TM-GW/EmGFP-miR載體中，構(gòu)建成分別針對(duì)HPV16E6和HPV18E

7、6的質(zhì)粒12MR0018A和12MR0018B(簡稱16E6-MiR、18E6-MiR);
　　 ③構(gòu)建分別沉默HPV16和HPV18病毒E6、E7基因的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系;
　　 ④Real-TimePCR方法分別檢測轉(zhuǎn)染前后EMT的標(biāo)志物E-鈣粘蛋白(E-cadherin)、N-鈣粘蛋白(N-cadherin)和β-連環(huán)素(β-catenin)的表達(dá)差異;Real-timePCR方法分別檢測轉(zhuǎn)染前后TGF-β1、TGF-

8、βRⅡ(TβRⅡ)和Smad4基因水平的變化。
　　 結(jié)果:
　　 1.成功構(gòu)建并轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒，在SiHa細(xì)胞系中，轉(zhuǎn)染質(zhì)粒16E6-MiR后HPV16E6基因的表達(dá)明顯下降，Real-TimePCR結(jié)果顯示有效抑制率為77％(P=0);轉(zhuǎn)染質(zhì)粒16E7-MiR-1、16E7-MiR-2、16E7-MiR-3和16E7-MiR-4后，質(zhì)粒16E7-MiR-2和16E7-MiR-4可以有效抑制HPV16E7基因的表達(dá)，Re

9、al-TimePCR結(jié)果顯示有效抑制率分別達(dá)到66％（P=0）和51％(P=0.003)，而質(zhì)粒16E7-MiR-1和16E7-MiR-3則無明顯抑制效果。
　　 2.在HeLa細(xì)胞系中，采用脂質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染方法分別轉(zhuǎn)染18E6-MiR質(zhì)粒，Real-TimePCR檢測HPV18E6基因的表達(dá)明顯下降，與未轉(zhuǎn)染Hela組相比下降約87％(P=0);轉(zhuǎn)染質(zhì)粒18E7-MiR-1、18E7-MiR-2、18E7-MiR-3和D18E7

10、-MiR-4后，18E7-MiR-1和18E7-MiR-4組HPV18E7基因的表達(dá)明顯下降，分別下降約68％(P=0)和55％(P=0)，而18E7-MiR-2和18E7-MiR-3則無明顯抑制效果。
　　 3.在SiHa組中，以質(zhì)粒16E6-MiR和沉默效率較高的質(zhì)粒16E7-MiR-2構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系，進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。Real-TimePCR結(jié)果示HPV16E6、E7基因表達(dá)被抑制后，EMT的標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)

11、明顯升高(P＜0.05)，而N-cadherin和β-catenin則明顯下降(P＜0.05)。
　　 當(dāng)HPV16E6、E7基因表達(dá)明顯被抑制后，Real-TimePCR示TGF-β1、TβRⅡ和Smad4基因的表達(dá)水平均明顯下降(P＜0.05)
　　 4.在HeLa組中，以質(zhì)粒18E6-MiR和沉默效率較高的質(zhì)粒18E7-MiR-1所構(gòu)建的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。Real-TimePCR結(jié)果示HPV18E6和E

12、7基因表達(dá)被明顯抑制后，EMT的標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)明顯升高(P＜0.05)，而N-cadherin和β-catenin則表達(dá)下降(P＜0.05)。
　　 當(dāng)HPV18E6、E7基因表達(dá)明顯被抑制后，Real-TimePCR示TGF-β1、TβRⅡ和Smad4基因的表達(dá)均下降(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1.在宮頸癌細(xì)胞中，HPV病毒的E6、E7基因可促進(jìn)上皮-間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化;當(dāng)E6、E7基因被