角質(zhì)細(xì)胞生長因子及受體在宮頸癌中的表達(dá)及作用研究.pdf

1、角質(zhì)細(xì)胞生長因子KGF來源于人肺成纖維細(xì)胞，屬成纖維母細(xì)胞生長因子家族成員。它由間質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生，并通過旁分泌方式作用于上皮細(xì)胞表面的角質(zhì)細(xì)胞生長因子受體KGFR,刺激上皮細(xì)胞有絲分裂和分化。KGFR位于上皮細(xì)胞內(nèi)，具有酪氨酸激酶活性，是FGFR2的剪接變體，即FGFR2Ⅲb。它可與FGF1、FGF3、KGF、FGF10結(jié)合而發(fā)揮其生理效能。研究發(fā)現(xiàn)KGF、KGFR與一系列上皮源性腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，它們參與腫瘤細(xì)胞增殖、遷移及抑制腫瘤細(xì)胞

2、凋亡等活動。近年國外有文獻(xiàn)報道在宮頸癌上皮細(xì)胞中KGF/KGFR的表達(dá)較正常宮頸上皮細(xì)胞中的表達(dá)明顯增高，推測其可能與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。目前國內(nèi)外普遍認(rèn)為人乳頭瘤病毒(HPV)與宮頸上皮內(nèi)瘤變及宮頸癌密切相關(guān)。臨床上發(fā)現(xiàn)，HPV感染會引起宮頸發(fā)生程度不一的各種病變，但僅有部分感染這些病毒的患者最終發(fā)展為宮頸癌。因此，宮頸癌的發(fā)生發(fā)展除HPV感染為主要的病因外，還有其它多種因素的參與。在一些腫瘤的研究中發(fā)現(xiàn)KGF/KGFR能促使腫瘤細(xì)

3、胞的增殖、遷移并抑制腫瘤細(xì)胞凋亡。在宮頸癌上皮組織中KGF/KGFR是否有高表達(dá)?目前文獻(xiàn)報道較少；KGF/KGFR在宮頸癌中的作用，對宮頸癌細(xì)胞的增殖、遷移. 目的： 確定角質(zhì)細(xì)胞生長因子(KGF)及其受體(KGFR)在正常宮頸組織、宮頸癌組織、Hela、CaSki細(xì)胞中有無表達(dá)；了解KGF、KGFR對Hela、CaSki細(xì)胞增殖、遷移、凋亡有無影響。 方法： 1、采用免疫組織化學(xué)方法分別對正常宮頸組織

4、(22例)和宮頸癌組織(31例)中KGF、KGFR的表達(dá)進(jìn)行測定，比較正常宮頸組織和宮頸癌組織中KGF、KGFR的表達(dá)有無差異。 2、采用半定量PCR方法在mRNA水平確定KGF/KGFR在Hela細(xì)胞和CaSki細(xì)胞中的表達(dá)；采用ELISA、Western blot方法在蛋白水平分別測定KGF、KGFR在Hela、CaSki細(xì)胞中的表達(dá)。 3、<'3>H-TdR摻入試驗測定人重組KGF對Hela、CaSki細(xì)胞、增殖的

5、影響；<'3>H-TdR摻入試驗、MTT測定KGF抗體、KGFR抗體對Hela、CaSki細(xì)胞增殖的影響。 4、Millicell小室測定法測定人重組KGF、KGF抗體、KGFR抗體對Hela、CaSki細(xì)胞遷移的影響。 5、流式細(xì)胞術(shù)、<'3>H-TdR摻入試驗檢測KGF對順鉑誘導(dǎo)Hela細(xì)胞凋亡的影響。 結(jié)果： 1、正常宮頸上皮細(xì)胞無KGF和KGFR表達(dá)，但宮頸癌上皮細(xì)胞中KGF和KGFR表達(dá)明顯，二

6、者在宮頸癌上皮細(xì)胞中的表達(dá)率分別為45％和71％：在Ⅱ a期宮頸癌中KGF、KGFR的陽性表達(dá)率高于原位癌(P<0.05)，但Ⅰ b期宮頸癌與原位癌及Ⅰ b期和Ⅱ a期宮頸癌中KGF、KGFR的表達(dá)在統(tǒng)計學(xué)上無差異(P>0.05)。宮頸癌出現(xiàn)深部間質(zhì)浸潤時KGF、KGFR的陽性表達(dá)率高于淺部間質(zhì)浸潤者(P<0.05)；KGF在低分化宮頸癌上皮細(xì)胞中的陽性表達(dá)率高于中、高分化宮頸癌(P<0.05)；KGFR在低分化宮頸癌上皮細(xì)胞中的表達(dá)與

7、高、中分化的宮頸癌相比，無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)；KGF與KGFR之間的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.9988，P<0.05)；在正常宮頸間質(zhì)及宮頸癌間質(zhì)中有少量KGF和KGFR表達(dá)，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理，二者表達(dá)無差異(P>0.05)： 2、在mRNA水平、蛋白水平證實KGF及KGFR在Hela、CaSki細(xì)胞中均有表達(dá)： RT-PCR測得Hela、CaSki細(xì)胞中KGF在143bp左右有特異條帶，KGFR在152bp左右有特異條帶：He

8、la細(xì)胞中KGF蛋白表達(dá)量為1.57±0.12pg/μg，CaSki細(xì)胞中KGF蛋白表達(dá)量為1.20±0.11pg/μg：Western blot測得Hela、CaSki細(xì)胞KGFR在蛋白水平有表達(dá)：在105KD處有清晰條帶。說明KGF在Hela、CaSki細(xì)胞中有自分泌現(xiàn)象。 3、KGF、KGFR對Hela，CaSki細(xì)胞增殖的影響：人重組KGF因子能使Hela、caski細(xì)胞增殖增強(qiáng)，并呈現(xiàn)一定的劑量依賴性。在加入人重組KG

9、F因子濃度為50ng/ml和100ng/ml兩組中，Hela、CaSki細(xì)胞的增殖與對照組相比差異顯著(P<0.05)；而加入2μg/ml KGF抗體和KGFR抗體后則能抑制Hela、CaSki細(xì)胞增殖，與對照組相比存在差異(P<0.05)。 4、KGF、KGFR對Hela、CaSki細(xì)胞遷移的影響：在相同時間內(nèi)，加入KGF 50ng/ml能使Millicell-PCF聚碳酸酯微孔膜下層的Hela、CaSki細(xì)胞數(shù)與對照組相比增

10、多(P<0.05)；而加入2μg/ml KGF抗體和KGFR抗體后，聚碳酸酯微孔膜下層的Hela、CaSki細(xì)胞數(shù)與對照組相比減少(P<0.05)；說明KGF能促使Hela CaSki細(xì)胞遷移，而且KGF對CaSki細(xì)胞遷移的影響大于Hela細(xì)胞；KGF抗體、KGFR抗體可抑制Hela CaSki細(xì)胞的遷移。 5、KGF對Hela細(xì)胞凋亡的影響：經(jīng)順鉑10μg/ml或KGFl00ng/ml+順鉑10μg/ml處理的兩組Hela細(xì)

11、胞，前者細(xì)胞凋亡率為20％；后者為10％，后者亞G1期峰明顯低于順鉑單獨處理組，提示KGF抑制了順鉑對Hela細(xì)胞的凋亡作用。<'3>H-TdR摻入試驗發(fā)現(xiàn)KGF 100ng/ml+順鉑10μg/ml組與順鉑10μg/ml組相比前者能使順鉑對Hela細(xì)胞的凋亡作用減弱，證明KGF可抑制順鉑對Hela細(xì)胞的凋亡作用。 結(jié)論： 1、在正常宮頸上皮細(xì)胞中KGF和KGFR的表達(dá)為陰性，在宮頸癌上皮細(xì)胞中KGF、KGFR的表達(dá)為陽

12、性，KGF的表達(dá)與KGFR的表達(dá)存在正相關(guān)，KGF、KGFR的表達(dá)與宮頸癌間質(zhì)浸潤深度、臨床分期有關(guān)，KGF在低分化宮頸癌上皮細(xì)胞中的表達(dá)高于高中分化宮頸癌，這些結(jié)果均提示KGF與KGFR可能與宮頸癌的增殖、侵襲有關(guān)。 2、在mRNA水平和蛋白水平證實KGF、KGFR在Hela、CaSki細(xì)胞中同時有表達(dá)，說明Hela、CaSki細(xì)胞能自分泌KGF。 3、外源性KGF、自分泌KGF及KGFR對Hela、CaSki細(xì)胞增殖