INPP4B對(duì)宮頸癌細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的調(diào)控及其在宮頸癌中的表達(dá).pdf

1、宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。據(jù)2012年統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，全球每年新發(fā)宮頸癌病例大約53萬(wàn)，其中約80％的病例在發(fā)展中國(guó)家。因此在發(fā)展中國(guó)家宮頸癌已成為女性中僅次于乳腺癌的第二殺手。
　　高危型人乳頭瘤病毒（human papillomavirus，HPV）感染和兩種病毒癌蛋白E6/E7的持續(xù)表達(dá)是誘導(dǎo)宮頸癌發(fā)生的主要因素。然而，在HPV感染人群中只有少數(shù)發(fā)展為宮頸癌，說(shuō)明HPV感染是宮頸癌發(fā)生的必要但不充分條件。高危型

2、HPV感染促進(jìn)了細(xì)胞向惡性轉(zhuǎn)化的發(fā)展，病毒感染后細(xì)胞基因的不穩(wěn)定性導(dǎo)致的突變積累以及細(xì)胞內(nèi)蛋白表達(dá)的變化是正常細(xì)胞轉(zhuǎn)化為腫瘤細(xì)胞的關(guān)鍵步驟。
　　磷脂酰肌醇4-磷酸酶Ⅱ型(INPP4B)是PI3K/AKT通路中的一種磷酸酶，其主要底物是磷脂酰肌醇3，4-二磷酸鹽[PI(3，4)P2]，INPP4B催化水解[PI(3，4)P2]的4位磷酸基團(tuán)生成磷脂酰肌醇3-磷酸鹽[PI(3)P]，降低[PI(3，4)P2]的水平。還有文獻(xiàn)報(bào)道IN

3、PP4B可以直接水解[PI(3，4，5)P3]中的4位磷酸基團(tuán)，減少[PI(3，4，5)P3]。通過(guò)這些反應(yīng)INPP4B可抑制AKT的活性。已有研究表明，作為PI3K/AKT途徑中的負(fù)調(diào)因子，INPP4B參與調(diào)控細(xì)胞增殖，細(xì)胞遷移，DNA損傷反應(yīng)等過(guò)程。
　　近幾年臨床與生物學(xué)研究佐證了INPP4B在腫瘤中的復(fù)雜作用。在乳腺癌、卵巢癌和黑色素瘤等腫瘤的雜合性缺失譜分析中發(fā)現(xiàn)INPP4B的雜合性缺失與患者存活率下降密切相關(guān)。在前列腺

4、癌、乳腺癌和黑色素瘤中，INPP4B可通過(guò)抑制AKT活性阻礙腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲以及小鼠移植瘤的生長(zhǎng)。然而，也有研究表明INPP4B在結(jié)腸癌、急性白血病(acute myeloid leukemia，AML)以及黑色素瘤中發(fā)揮了致癌活性，INPP4B通過(guò)激活SGK3(serum-andglucocorticoid-regulated kinase3，SGK3)途徑促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖。所以，INPP4B的作用具有腫瘤甚至細(xì)胞特異性。迄今為

5、止，INPP4B在宮頸癌中的表達(dá)及其對(duì)宮頸癌細(xì)胞的作用尚未見(jiàn)報(bào)道，本研究通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)探索了INPP4B對(duì)宮頸癌細(xì)胞生長(zhǎng)增殖、周期和凋亡的影響及其分子機(jī)制，并進(jìn)一步觀察分析了INPP4B在臨床宮頸癌標(biāo)本中的表達(dá)狀況。
　　1.INPP4B抑制宮頸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖
　　目的:研究INPP4B對(duì)宮頸癌細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的影響。方法:將INPP4B表達(dá)質(zhì)粒LHCX-INPP4B轉(zhuǎn)染INPP4B表達(dá)缺失的HeLa細(xì)胞，SiHa細(xì)胞以及C3

6、3a細(xì)胞，通過(guò)CCK-8實(shí)驗(yàn)，BrdU實(shí)驗(yàn)以及克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)上述宮頸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖。同時(shí)利用細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒檢測(cè)INPP4B對(duì)細(xì)胞凋亡的影響。在INPP4B高表達(dá)的CaSki細(xì)胞中采用INPP4B特異性siRNA干擾其表達(dá)，用克隆形成及BrdU實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的增殖活性。結(jié)果: CCK-8和克隆形成實(shí)驗(yàn)顯示，過(guò)表達(dá)INPP4B使宮頸癌細(xì)胞活性和克隆形成能力明顯下降，BrdU實(shí)驗(yàn)表明，轉(zhuǎn)染INPP4B后宮頸癌細(xì)胞進(jìn)入S期的細(xì)胞比例減少。

7、特異性siRNA干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，敲低INPP4B表達(dá)促進(jìn)了CaSki細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖。但過(guò)表達(dá)INPP4B對(duì)上述宮頸癌細(xì)胞的細(xì)胞凋亡無(wú)明顯影響。結(jié)論:INPP4B可抑制宮頸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖和細(xì)胞周期進(jìn)程，但對(duì)宮頸癌細(xì)胞凋亡沒(méi)有明顯促進(jìn)作用。
　　2.INPP4B表達(dá)對(duì)宮頸癌細(xì)胞中AKT活性的影響
　　目的:觀察宮頸癌細(xì)胞中INPP4B表達(dá)對(duì)AKT活性的影響。方法:在HeLa，SiHa和C33a細(xì)胞中過(guò)表達(dá)INPP4B，在Ca

8、Ski細(xì)胞中敲低INPP4B表達(dá)，48h后收集細(xì)胞蛋白行western blot檢測(cè)。結(jié)果:與對(duì)照細(xì)胞相比，過(guò)表達(dá)INPP4B導(dǎo)致HeLa和C33a細(xì)胞中pAKT表達(dá)含量降低，但敲低INPP4B表達(dá)對(duì)CaSki細(xì)胞中pAKT水平?jīng)]有明顯影響。結(jié)論:INPP4B抑制宮頸癌細(xì)胞增殖的作用可能部分依賴于其對(duì)AKT活性的負(fù)調(diào)控。
　　3.HPV E6/E7蛋白對(duì)宮頸癌細(xì)胞INPP4B表達(dá)的影響
　　目的:探討HPV E6/E7轉(zhuǎn)化蛋

9、白對(duì)INPP4B表達(dá)的影響。方法:選擇高表達(dá)INPP4B并有HPV16 E6，E7表達(dá)背景的CaSki細(xì)胞，采用特異性siRNA單獨(dú)敲低E6表達(dá)或同時(shí)敲低E6和E7表達(dá)，western blot檢測(cè)有關(guān)蛋白的表達(dá)。結(jié)果:敲低E6、以及E6/E7表達(dá)后，CaSki細(xì)胞中p53蛋白水平增加，pAKT表達(dá)水平明顯降低，INPP4B表達(dá)輕度降低。結(jié)論: HPV E6/E7癌蛋白可促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞中pAKT活性增高，并有可能通過(guò)PI3K/AKT途徑

10、的反饋調(diào)節(jié)影響INPP4B的表達(dá)。
　　4.INPP4B抑制裸鼠體內(nèi)宮頸癌細(xì)胞移植瘤的生長(zhǎng)
　　目的:通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證INPP4B對(duì)宮頸癌細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的抑制作用。方法:利用本室構(gòu)建的INPP4B穩(wěn)轉(zhuǎn)宮頸癌細(xì)胞株GV367-INPP4B HeLa，注射小鼠皮下建立裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。成瘤后進(jìn)行動(dòng)物活體成像拍照以及裸鼠移植瘤重量，大小等指標(biāo)的分析，觀察INPP4B過(guò)表達(dá)對(duì)宮頸癌移植瘤生長(zhǎng)的影響。結(jié)果:與對(duì)照GV367-HeL

11、a細(xì)胞相比，穩(wěn)定表達(dá)INPP4B蛋白的GV367-INPP4BHeLa細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的生長(zhǎng)速度明顯緩慢，最終形成腫瘤的大小和重量也明顯低于對(duì)照組。結(jié)論:過(guò)表達(dá)INPP4B可在體內(nèi)抑制裸鼠宮頸癌異體移植瘤的生長(zhǎng)。
　　5.臨床宮頸組織中INPP4B蛋白的表達(dá)
　　目的:研究正常宮頸以及宮頸鱗癌組織中INPP4B的表達(dá)情況。方法:收取臨床正常宮頸以及宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織，real time-PCR以及免疫組化方法檢測(cè)INPP4B的

12、表達(dá)。結(jié)果:免疫組化表明，66例宮頸鱗癌組織中，INPP4B陽(yáng)性率為39.4％，INPP4B缺失率接近60％。在43例正常宮頸鱗狀上皮中，INPP4B陽(yáng)性率為32.5％。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明，正常宮頸與宮頸癌組織中INPP4B的表達(dá)水平?jīng)]有顯著差異，real time PCR與免疫組化的結(jié)果一致。上述結(jié)果與Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)中的已有數(shù)據(jù)相符。結(jié)論:INPP4B表達(dá)在正常宮頸組織與宮頸鱗癌組織中沒(méi)有明顯差異。我們分析正常宮頸組織中INPP4

13、B的表達(dá)率較低的原因，可能與正常宮頸細(xì)胞中缺少改變細(xì)胞生長(zhǎng)的刺激因素，使INPP4B表達(dá)未被充分誘導(dǎo)有關(guān)。
　　綜上所述，本研究利用體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)探究了INPP4B對(duì)宮頸癌細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的影響，并初步觀察了INPP4B在臨床宮頸標(biāo)本中的表達(dá)特點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn):1）過(guò)表達(dá)INPP4B對(duì)宮頸癌細(xì)胞生長(zhǎng)增殖有抑制作用。2）INPP4B過(guò)表達(dá)可抑制裸鼠體內(nèi)宮頸癌細(xì)胞移植瘤的生長(zhǎng)。3)INPP4B對(duì)宮頸癌細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的抑制作用部分依賴于其對(duì)于AKT活