GCNF在宮頸癌細(xì)胞中的表達(dá)及其作用初探.pdf

1、目的：觀察GCNF基因在正常宮頸、宮頸上皮內(nèi)瘤變、宮頸癌組織以及體外培養(yǎng)宮頸癌細(xì)胞系（HeLa細(xì)胞）中的表達(dá)。構(gòu)建人pcDNA3.1–GCNF真核表達(dá)載體，研究GCNF基因重組質(zhì)粒表達(dá)產(chǎn)物對(duì)體外培養(yǎng)宮頸癌細(xì)胞增殖、凋亡、黏附和侵襲力的影響。
　　 方 法：（1）收集我校一附院病理科正常宮頸、宮頸上皮內(nèi)瘤變、宮頸癌（鱗癌）組織蠟塊，并體外培養(yǎng)HeLa細(xì)胞，用免疫組織化學(xué)SP法觀察GCNF基因在上述組織、細(xì)胞中的表達(dá)。（2）采用PC

2、R的方法從pMD18–T-GCNF載體中擴(kuò)增全長(zhǎng)GCNF cDNA, 酶切擴(kuò)增產(chǎn)物及pcDNA3.1(-)載體質(zhì)粒，酶切產(chǎn)物電泳回收后進(jìn)行定向連接，構(gòu)建pcDNA3.1-GCNF重組質(zhì)粒，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α,進(jìn)行菌落PCR鑒定。擴(kuò)增后提取重組質(zhì)粒DNA進(jìn)行PCR鑒定并制成甘油菌送往公司測(cè)序；（3）脂質(zhì)體介導(dǎo)法瞬時(shí)轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒至宮頸癌HeLa細(xì)胞，RT-PCR以及間接免疫熒光鑒定轉(zhuǎn)染結(jié)果；（4）倒置顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞形

3、態(tài)的變化；MTT法檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞增殖的變化；Annexin V-PI雙染流式細(xì)胞術(shù)分析轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞凋亡情況；基質(zhì)黏附實(shí)驗(yàn)觀察轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞黏附情況；Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞的侵襲能力。
　　 結(jié) 果：1.正常宮頸GCNF呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)；CINⅠ中GCNF呈陽(yáng)性表達(dá)；CINⅡ中只有個(gè)別細(xì)胞表達(dá)GCNF；CINⅢ中GCNF不表達(dá)；宮頸癌組織中GCNF不表達(dá)；HeLa細(xì)胞中GCNF不表達(dá)；2. PCR凝膠電泳在1450

4、bp附近得到目的條帶，經(jīng)雙酶切后與載體質(zhì)粒連接得到pcDNA3.1-GCNF重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌并經(jīng)菌落PCR篩選得到單克隆菌株，抽提質(zhì)粒DNA并經(jīng)質(zhì)粒PCR鑒定后測(cè)序，與基因庫(kù)中登錄的GCNF序列比較，符合率99.99%；3.陽(yáng)性重組質(zhì)粒脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，RT-PCR凝膠電泳顯示轉(zhuǎn)染目的基因后在200bp附近可見(jiàn)一條明亮的目的條帶，其灰度比值（98.82±0.79）%明顯高于未轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組（9.67±0.29，10

5、.29±0.59）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；間接免疫熒光結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染目的基因后，大部分HeLa細(xì)胞的GCNF呈陽(yáng)性表達(dá)，轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒和未轉(zhuǎn)染組HeLa細(xì)胞無(wú)GCNF表達(dá)；4.轉(zhuǎn)染后細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯變化；MTT結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染目的基因后HeLa細(xì)胞光吸收值最大（0.239±0.011），高于未轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組（0.203±0.009，0.196±0.016）（P<0.05）；流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡細(xì)胞，顯示轉(zhuǎn)染目的基因后細(xì)胞凋亡率

6、最低為11.46%（P<0.05），空質(zhì)粒和未轉(zhuǎn)染組的凋亡率分別為16.5%和15.34%；同樣的干預(yù)條件用基質(zhì)黏附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移率，和Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲力，發(fā)現(xiàn)各小組之間沒(méi)有明顯差異。
　　 結(jié) 論：(1)GCNF基因在正常宮頸組織中高表達(dá)可能與上皮細(xì)胞的正常分化有關(guān)；(2)首次觀察到GCNF基因在CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ中表達(dá)由強(qiáng)變?nèi)踔翆m頸浸潤(rùn)癌表達(dá)完全消失，提示GCNF基因可能未參與宮頸上皮細(xì)胞的