宮頸脫落細(xì)胞microRNA檢測(cè)在宮頸癌篩查中的作用.pdf

1、宮頸癌是目前世界上第三高發(fā)的女性惡性腫瘤，其發(fā)生一般需經(jīng)歷從正常宮頸上皮到不同級(jí)別癌前病變的過(guò)程，平均需5-20年。根據(jù)宮頸癌發(fā)病率較高和發(fā)病過(guò)程較緩慢的特點(diǎn)，結(jié)合宮頸易于被暴露和取材的特點(diǎn)，宮頸癌是目前唯一被世界衛(wèi)生組織確定為可以通過(guò)篩查降低浸潤(rùn)癌發(fā)生率的惡性腫瘤。
　　高危型人乳頭瘤病毒(HPV)檢測(cè)和宮頸細(xì)胞學(xué)檢查是目前最主要的兩種宮頸癌篩查方法。HPV檢測(cè)具有敏感性高，陰性預(yù)測(cè)值高，結(jié)果客觀可靠等優(yōu)點(diǎn)。歐洲生殖道感染和腫瘤

2、研究組織(European Research Organization on GenitalInfection and Neoplasia，EUROGIN)已經(jīng)推薦HPV檢測(cè)作為宮頸癌篩查的初篩手段。在許多歐洲國(guó)家和一些細(xì)胞病理學(xué)醫(yī)生相對(duì)較為缺乏的發(fā)展中國(guó)家， HPV檢測(cè)已被廣泛用于宮頸癌的初篩。HPV檢測(cè)的最大局限性是陽(yáng)性預(yù)測(cè)值低，在HPV檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性的大量人群中，實(shí)際發(fā)生或?qū)l(fā)生宮頸上皮內(nèi)瘤變或?qū)m頸癌的患者很少。因此，HPV檢測(cè)可

3、能導(dǎo)致HPV陽(yáng)性婦女產(chǎn)生不必要的心理焦慮，甚至過(guò)度診療。宮頸細(xì)胞學(xué)檢查具有特異性高和陽(yáng)性預(yù)測(cè)值高的優(yōu)點(diǎn)，已被EUROGIN推薦用于HPV初篩后的分層篩查。但宮頸細(xì)胞學(xué)檢查的敏感性較低，僅38％～65％，而且，結(jié)果判斷有較大的主觀性，依賴(lài)于經(jīng)過(guò)專(zhuān)業(yè)培訓(xùn)的細(xì)胞病理學(xué)醫(yī)生，而這在我國(guó)許多欠發(fā)達(dá)地區(qū)仍是嚴(yán)重缺乏的。因此，在HPV初篩陽(yáng)性婦女中，探索一種新的分層篩查方法意義重大。
　　MicroRNA(miRNA)是一類(lèi)基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)因子，

4、參與細(xì)胞凋亡，細(xì)胞增殖，和細(xì)胞分化等許多重要生物學(xué)過(guò)程。在許多人類(lèi)惡性腫瘤中均已發(fā)現(xiàn)存在miRNA表達(dá)異常。近來(lái)，一些研究評(píng)估了miRNA作為生物標(biāo)記物在腫瘤診斷中的價(jià)值，并取得了較好的結(jié)果。宮頸癌及其癌前病變中也存在miRNA表達(dá)異常。研究表明miR-218和miR-34a在宮頸癌的發(fā)生中具有抑癌基因的作用。在我們先前的研究中，首次在宮頸癌及其癌前病變組織中發(fā)現(xiàn)了14個(gè)表達(dá)下調(diào)的miRNA（包括miR-375和miR-424等）和17

5、個(gè)表達(dá)上調(diào)的miRNA（包括miR-93和miR-92a等）。我們進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)miR-375，miR-424，和miR-93分別通過(guò)作用于Sp1，Chk1，和RAB11FIP1參與宮頸癌的發(fā)生和發(fā)展。其他研究也發(fā)現(xiàn)miR-34a參與HPV E6-p53降解途徑， miR-218通過(guò)靶基因LAMB3參與宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展。這些miRNA在宮頸癌及其癌前病變中的異常表達(dá)提示它們可作為宮頸癌的生物標(biāo)記物，在宮頸癌篩查中具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值

6、。
　　根據(jù)一些miRNA在宮頸癌及其癌前病變組織中異常表達(dá)的情況，以及它們?cè)趯m頸癌發(fā)生、發(fā)展中的作用機(jī)制，我們?cè)诒狙芯恐羞x擇了6個(gè)miRNA(miR-424，miR-375，miR-218，miR-34a，miR-92a和miR-93)作為宮頸癌篩查的候選生物標(biāo)記物。首先研究了miRNA在正常宮頸、宮頸上皮內(nèi)瘤變及浸潤(rùn)性宮頸癌的宮頸脫落細(xì)胞中的表達(dá)情況;在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步評(píng)估比較了宮頸脫落細(xì)胞miRNA檢測(cè)和宮頸細(xì)胞學(xué)檢查在HP

7、V初篩陽(yáng)性婦女中的分層篩查價(jià)值。
　　第一部分 miRNA在正常宮頸、宮頸上皮內(nèi)瘤變及浸潤(rùn)性宮頸癌的宮頸脫落細(xì)胞中的表達(dá)
　　目的：
　　比較并證實(shí)在正常宮頸、宮頸上皮內(nèi)瘤變及浸潤(rùn)性宮頸癌的宮頸脫落細(xì)胞中候選miRNA的表達(dá)水平存在顯著差異。
　　方法：
　　研究對(duì)象入組標(biāo)準(zhǔn):年齡30-65歲;宮頸完整;否認(rèn)既往宮頸上皮內(nèi)瘤變(Cervical intraepithelial neoplasia，CIN)，

8、或?qū)m頸癌，或其他惡性腫瘤病史;非孕婦。收集宮頸脫落細(xì)胞，用Stem loop RT-qPCR方法在宮頸脫落細(xì)胞中檢測(cè)候選miRNA(miR-424,miR-375,miR-34a,miR-218,miR-93, miR-92a)的相對(duì)表達(dá)水平（以U6為內(nèi)參）。以宮頸組織學(xué)診斷作為分組依據(jù)，比較CIN1-(≤CIN1)組和CIN2+（≥CIN2）組， CIN2-組和CIN3+組，CIN3-組和ICC(Invasive cervical c

9、ancer)組之間各候選miRNA的相對(duì)表達(dá)水平。用SPSS17.0軟件統(tǒng)計(jì)分析，具體統(tǒng)計(jì)方法為Student t檢驗(yàn)和非參數(shù)Mann-Whitney U檢驗(yàn)。所有統(tǒng)計(jì)分析都采用雙側(cè)檢驗(yàn)， P＜0.05時(shí)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。
　　結(jié)果：
　　1.共收集有效病例735例，其中:240例正常宮頸，100例CIN1，111例CIN2，117例CIN3，167例ICC。
　　2.CIN1-組與CIN2+組、CIN2-組與CI

10、N3+組、CIN3-組與ICC組之間的年齡分布均無(wú)顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。
　　3.CIN1-組、CIN2-組和CIN3-組的宮頸脫落細(xì)胞中miR-424、miR-375、miR-34a和miR-218的相對(duì)表達(dá)水平分別顯著低于它們?cè)贑IN2+組、CIN3+組和ICC組中的相對(duì)表達(dá)水平(P＜0.001)。miR-92a和miR-93的相對(duì)表達(dá)水平在上述各組之間無(wú)顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。
　　結(jié)論:

11、　　1.在宮頸脫落細(xì)胞中檢測(cè)miRNA簡(jiǎn)便可行。
　　2.miR-424、miR-375、miR-34a和miR-218在高級(jí)別宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN2-3)和浸潤(rùn)性宮頸癌的宮頸脫落細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)水平顯著低于它們?cè)诘图?jí)別宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN1)和正常宮頸中的表達(dá)。miR-92a和miR-93在不同宮頸組織病理狀態(tài)的宮頸脫落細(xì)胞中的表達(dá)沒(méi)有顯著差異。
　　3.miR-424、miR-375、miR-34a和miR-218在

12、宮頸癌篩查中具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。
　　第二部分比較宮頸脫落細(xì)胞miRNA檢測(cè)和宮頸細(xì)胞學(xué)檢查在HPV陽(yáng)性婦女中的分層篩查作用
　　目的:
　　比較宮頸脫落細(xì)胞miRNA檢測(cè)和宮頸細(xì)胞學(xué)檢查在HPV陽(yáng)性婦女中的分層篩查作用。
　　方法：
　　研究對(duì)象入組標(biāo)準(zhǔn):年齡30-65歲;宮頸HPV初篩陽(yáng)性;宮頸完整;否認(rèn)既往CIN，或?qū)m頸癌，或其他惡性腫瘤病吏;非孕婦。所有研究對(duì)象均行宮頸細(xì)胞學(xué)檢查和宮頸脫落細(xì)胞m

13、iRNA檢測(cè)(miR-424，miR-375， miR-34a，miR-218，miR-93， miR-92a)，并接受陰道鏡檢查。宮頸細(xì)胞學(xué)檢查和陰道鏡檢查均陰性者不做宮頸活檢術(shù)，視作組織學(xué)正常;宮頸細(xì)胞學(xué)檢查陰性，但陰道鏡檢查發(fā)現(xiàn)異常者行宮頸活檢術(shù);宮頸細(xì)胞學(xué)檢查異常者，無(wú)論陰道鏡檢查是否發(fā)現(xiàn)異常，均行宮頸活檢術(shù)。宮頸細(xì)胞學(xué)檢查采用ThinPrep液基細(xì)胞學(xué)方法;高危型HPV檢測(cè)采用雜交捕獲-2（Hybrid Capture-2，H

14、C2）的方法;miRNA檢測(cè)采用Stem loopRT-qPCR方法（以U6為內(nèi)參）。所有統(tǒng)計(jì)學(xué)分析均采用SPSS17.0軟件。用非參數(shù)Mann-Whitney U檢驗(yàn)比較不同宮頸組織學(xué)分組之間的宮頸脫落細(xì)胞miRNA表達(dá)水平;用ROC曲線， Pearson卡方檢驗(yàn)和Logistic回歸分析等比較miRNA檢測(cè)與宮頸細(xì)胞學(xué)檢查在診斷高級(jí)別宮頸上皮內(nèi)瘤變中的作用。所有統(tǒng)計(jì)學(xué)分析均采用雙側(cè)檢驗(yàn)，P＜0.05時(shí)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。
　

15、　結(jié)果：
　　1.共收集有效病例1021例，這些病例最終被診斷為:579例正常宮頸，83例CIN1，144例CIN2，208例CIN3，和7例ICC。
　　2.CIN1-組與CIN2+組、CIN2-組與CIN3+組之間的年齡分布無(wú)顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。miR-424，miR-375，miR-34a，miR-218在CIN2+組和CIN3+組中的相對(duì)表達(dá)水平分別顯著低于它們?cè)贑IN1-組和CIN2-組中的相對(duì)表達(dá)水

16、平(P＜0.001)。
　　3.在HPV陽(yáng)性婦女中分層篩查CIN2+時(shí)，與宮頸細(xì)胞學(xué)檢查相比:miR-424和miR-375檢測(cè)的敏感性（76.4％和74.9％ vs.63.8％; P＜0.05），陽(yáng)性預(yù)測(cè)值（65.3％和66.3％ vs.58.4％; P＜0.05）和陰性預(yù)測(cè)值（85.7％和85.4％ vs.79.3％;P＜0.05）均顯著高于宮頸細(xì)胞學(xué)檢查;特異性無(wú)顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在HPV陽(yáng)性婦女中分層篩查CIN3+時(shí)，與宮

17、頸細(xì)胞學(xué)檢查相比:miR-424和miR-375檢測(cè)的敏感性（82.3％和80.9％ vs.69.8％;P＜0.05）和陰性預(yù)測(cè)值(93.8％和93.4％ vs.89.7％;P＜0.05)均顯著高于宮頸細(xì)胞學(xué)檢查;特異性和陽(yáng)性預(yù)測(cè)值均無(wú)顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　4.通過(guò)Logistic回歸分析，得到兩個(gè)分別用于分層篩查CIN2+和CIN3+的聯(lián)合檢測(cè)模型:m iR-424/375/218和miR-424/375。這兩個(gè)聯(lián)合檢測(cè)模型在

18、篩查高級(jí)別宮頸上皮內(nèi)瘤變時(shí)的敏感性、特異性、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值均顯著高于宮頸細(xì)胞學(xué)檢查;與單一miR-424或miR-375檢測(cè)相比，兩種聯(lián)合檢測(cè)的特異性有顯著提高，敏感性、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值均無(wú)顯著差異。
　　結(jié)論：
　　1.在HPV陽(yáng)性婦女中分層篩查高級(jí)別宮頸上皮內(nèi)瘤變時(shí)，與宮頸細(xì)胞學(xué)檢查相比，miR-424和miR-375檢測(cè)在保持特異性和陽(yáng)性預(yù)測(cè)值不下降的同時(shí)，敏感性和陰性預(yù)測(cè)值均顯著優(yōu)于宮頸細(xì)胞學(xué)檢查。