REC8在肝細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、肝癌是臨床上最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率男性多于女性，根據(jù)最新統(tǒng)計(jì)，在全世界發(fā)展中國家的男性中，肝癌是癌癥死亡的第二大原因，在發(fā)達(dá)國家的男性中，排名癌癥死亡的第六位。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在2012年期間全世界大約有78.25萬新增肝癌病例，因肝癌死亡的人數(shù)大約74.55萬例，而我國就占了新增病例及死亡病例總數(shù)的50％。肝細(xì)胞癌是肝癌的主要類型，占肝癌的70-90%。然而肝細(xì)胞癌形成和發(fā)展的具體機(jī)制仍不清楚，缺乏有效治療方法。目前手術(shù)切除仍是治療肝

2、細(xì)胞癌的首選方法，然而根治性切除后患者的5年復(fù)發(fā)率高、轉(zhuǎn)移率高，這成為肝細(xì)胞癌臨床治療的難題。因此，從分子水平研究肝細(xì)胞癌的發(fā)生機(jī)制，并針對此尋找有效的治療措施成為當(dāng)今肝細(xì)胞癌研究中的重點(diǎn)和難點(diǎn)。
　　REC8是構(gòu)成染色體結(jié)構(gòu)維持蛋白復(fù)合體黏著素中的一員。黏著素在細(xì)胞有絲分裂及減數(shù)分裂中發(fā)揮調(diào)整染色體分離和同源重組的作用，參與DNA損傷修復(fù)，在真核細(xì)胞增殖過程中起著至關(guān)重要的作用。染色體的正確分離對于細(xì)胞的增殖非常重要，染色體的分

3、離異常與多種疾病相關(guān)，尤其在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。同時(shí)黏著素在轉(zhuǎn)錄過程中可以與DNA結(jié)合調(diào)控增強(qiáng)子與啟動(dòng)子的相互作用。能夠參與多種基因的表達(dá)調(diào)控，如原癌基因、癌基因的表達(dá)調(diào)控，同時(shí)與CCCTC-結(jié)合因子(CCCTC-binding factor, CTCF)共定位于染色體，通過CTCF的作用調(diào)控轉(zhuǎn)錄，因此黏著素在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。REC8是黏著素家族中新近發(fā)現(xiàn)的一員，它屬于黏著素減數(shù)分裂特異亞基，進(jìn)入減數(shù)分裂Ⅰ期

4、，
　　RAD21被減數(shù)分裂特異的黏著素亞基REC8取代。同時(shí)REC8是腫瘤/睪丸(Cancer/Testis,CT)基因的一員，這類基因生理狀態(tài)下在生殖細(xì)胞系高表達(dá)，在癌癥中被異常激活，它們在癌癥細(xì)胞生理學(xué)的作用仍有待闡明。近期研究發(fā)現(xiàn)在胃腸間質(zhì)瘤中出現(xiàn)REC8的異常甲基化，在多倍體腫瘤細(xì)胞中表達(dá)異常，在胃癌、甲狀腺癌中表現(xiàn)出抑癌作用。
　　目前，國內(nèi)外尚未見到有關(guān)REC8在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)及其作用機(jī)制的研究報(bào)道。本研究觀

5、察REC8在人類肝細(xì)胞癌組織及肝癌細(xì)胞系的表達(dá)，研究其對肝癌細(xì)胞增殖、凋亡、遷移、侵襲、血管形成等生物學(xué)行為的影響，并探討它在肝癌細(xì)胞中的作用機(jī)制，為肝細(xì)胞癌提供新的治療靶點(diǎn)。
　　第一部分：REC8在肝細(xì)胞癌組織及肝癌細(xì)胞中的表達(dá)
　　目的：
　　觀察REC8在肝細(xì)胞癌組織及癌旁組織中的表達(dá)情況，以及REC8在肝癌細(xì)胞系和肝細(xì)胞系的表達(dá)情況。
　　方法：
　　收集河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院肝膽外科2015年1月

6、-2016年12月行手術(shù)切除并經(jīng)術(shù)后病理證實(shí)為肝細(xì)胞癌患者40例。實(shí)驗(yàn)標(biāo)本共80例，包括新鮮肝細(xì)胞癌組織標(biāo)本40例及相應(yīng)癌旁組織40例。應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色法、Real-time PCR、蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測REC8在肝細(xì)胞癌組織及相應(yīng)癌旁組織的表達(dá)水平及特點(diǎn)，應(yīng)用細(xì)胞免疫熒光染色分析、蛋白免疫印跡法檢測肝癌細(xì)胞以及肝細(xì)胞中的REC8的表達(dá)水平及特點(diǎn)。
　　結(jié)果：
　　1.REC8在肝癌組織中主要定位于細(xì)胞核，在癌旁組織中主

7、要定位于細(xì)胞漿，在肝癌組織細(xì)胞核中表達(dá)較癌旁組織增高
　　免疫組織化學(xué)染色結(jié)果REC8在肝細(xì)胞癌組織及癌旁組織中均有表達(dá)，但在肝細(xì)胞癌組織中REC8主要定位于細(xì)胞核，在癌旁組織中REC8主要定位于細(xì)胞漿，REC8在細(xì)胞核的表達(dá)明顯高于癌旁組織(P<0.01)。Real-time PCR結(jié)果顯示在肝癌組織中REC8 mRNA的表達(dá)與癌旁組織沒有顯著差別(P>0.05)。蛋白免疫印跡法結(jié)果顯示在肝癌組織中 REC8在細(xì)胞核的表達(dá)水平高

8、于癌旁組織(P<0.01)，提示REC8可能在肝細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用。
　　2.REC8在肝癌細(xì)胞中主要表達(dá)于細(xì)胞核，在肝細(xì)胞中主要表達(dá)于細(xì)胞漿，在肝癌細(xì)胞系細(xì)胞核中表達(dá)較肝細(xì)胞增高
　　細(xì)胞免疫熒光染色分析的結(jié)果表明在HepG2、HuH-7、BEL-7402三種肝癌細(xì)胞中REC8主要表達(dá)于細(xì)胞核，而在QSG-7701肝細(xì)胞中REC8在細(xì)胞核、細(xì)胞漿均有表達(dá)，主要表達(dá)于細(xì)胞漿。蛋白免疫印跡法實(shí)驗(yàn)檢測肝癌細(xì)胞、肝細(xì)胞細(xì)胞

9、核內(nèi)的REC8表達(dá)，當(dāng)上樣蛋白總量為150μg時(shí)結(jié)果顯示三種肝癌細(xì)胞系中細(xì)胞核內(nèi)REC8的表達(dá)高于肝細(xì)胞(P<0.05)，提示REC8可能在肝細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用。
　　第二部分：REC8對肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響
　　目的：
　　應(yīng)用pcDNA3.1-Flag-REC8質(zhì)粒轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞建立REC8過表達(dá)肝癌細(xì)胞模型，觀察REC8對肝癌細(xì)胞增殖、凋亡、遷移侵襲、血管生成能力等生物學(xué)行為的影響。
　　方法：<

10、br>　　應(yīng)用pcDNA3.1-Flag-REC8質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染 HepG2、HuH-7、BEL-7402三種肝癌細(xì)胞(REC8組)，以空載體(Control組)作為對照組，之后再利用蛋白免疫印跡檢測PCNA蛋白表達(dá)、細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)、CCK-8實(shí)驗(yàn)觀察肝癌細(xì)胞增殖能力的變化；使用蛋白免疫印跡法檢測Cleaved-Caspase3蛋白表達(dá)、流式細(xì)胞儀Annexin V/PI雙染細(xì)胞凋亡觀察肝癌細(xì)胞凋亡的變化；應(yīng)用蛋白免疫印跡法檢測MMP-

11、9、Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)觀察肝癌細(xì)胞遷移、侵襲能力的改變；應(yīng)用蛋白免疫印跡法檢測 VEGF-C、小管形成實(shí)驗(yàn)觀察肝癌細(xì)胞對血管形成能力的改變。
　　結(jié)果：
　　1.pcDNA3.1-Flag-REC8質(zhì)粒過表達(dá)REC8的效果鑒定
　　應(yīng)用pcDNA3.1-Flag-REC8質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染HepG2、HuH-7、BEL-7402三種肝癌細(xì)胞，以空載體作為對照組，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-Flag-REC8質(zhì)

12、粒后 REC8的mRNA水平和蛋白水平均明顯上調(diào)(P<0.01)，證實(shí)pcDNA3.1-Flag-REC8質(zhì)粒在三種肝癌細(xì)胞中均可成功過表達(dá)REC8。
　　2.過表達(dá)REC8抑制肝癌細(xì)胞的增殖
　　蛋白免疫印跡法分析結(jié)果證明，與Control組比較，轉(zhuǎn)染REC8過表達(dá)質(zhì)粒48h后，在HepG2、HuH-7、BEL-7402三種肝癌細(xì)胞中PCNA表達(dá)均下降(P<0.01)，表明在肝癌細(xì)胞系中，過表達(dá)REC8后，抑制肝癌細(xì)胞的增

13、殖能力。細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與 Control組比較，轉(zhuǎn)染REC8過表達(dá)質(zhì)粒48h后，在HepG2、HuH-7、BEL-7402三種肝癌細(xì)胞中細(xì)胞克隆形成數(shù)量減少(P<0.01)，表明過表達(dá)REC8后，肝癌細(xì)胞克隆形成受到抑制。CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與Control組比較，轉(zhuǎn)染REC8過表達(dá)質(zhì)粒24h、48h、72h后， HepG2、HuH-7、BEL-7402三種肝癌細(xì)胞增殖能力均下降(P<0.05)。
　　3.過表達(dá)R

14、EC8促進(jìn)肝癌細(xì)胞的凋亡
　　蛋白免疫印跡法分析結(jié)果證明，與Control組比較，轉(zhuǎn)染REC8過表達(dá)質(zhì)粒48h后，在HepG2、HuH-7、BEL-7402三種肝癌細(xì)胞中Cleaved-Caspase3表達(dá)均上升(P<0.01)，表明在肝癌細(xì)胞系中，過表達(dá)REC8促進(jìn)肝癌細(xì)胞的凋亡。流式細(xì)胞儀Annexin V/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測實(shí)驗(yàn)證明，與Control組比較，轉(zhuǎn)染REC8過表達(dá)質(zhì)粒48h后，在HepG2、HuH-7、BEL-

15、7402三種肝癌細(xì)胞中細(xì)胞早期凋亡率升高(P<0.01)，表明過表達(dá)REC8促進(jìn)肝癌細(xì)胞的凋亡。
　　4.過表達(dá)REC8促進(jìn)肝癌細(xì)胞的遷移、侵襲
　　蛋白免疫印跡法分析結(jié)果證明，與Control組比較，轉(zhuǎn)染REC8過表達(dá)質(zhì)粒48h后，在HepG2、HuH-7、BEL-7402三種肝癌細(xì)胞中MMP-9表達(dá)均上調(diào)(P<0.01)，表明在肝癌細(xì)胞系中，過表達(dá) REC8增加肝癌細(xì)胞的遷移、侵襲能力。Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明

16、，與Control組比較，轉(zhuǎn)染REC8過表達(dá)質(zhì)粒48h后， HepG2、HuH-7、BEL-7402三種肝癌細(xì)胞的侵襲能力增加，穿到Transwell小室下層的細(xì)胞數(shù)增加(P<0.01)，表明過表達(dá)REC8增加肝癌細(xì)胞的侵襲能力。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，與Control組比較，轉(zhuǎn)染REC8過表達(dá)質(zhì)粒48h后， HepG2、HuH-7、BEL-7402三種肝癌細(xì)胞的劃痕愈合能力增加(P<0.01)，表明過表達(dá)REC8增加肝癌細(xì)胞的遷

17、移能力。
　　5.過表達(dá)REC8促進(jìn)肝癌細(xì)胞的血管形成
　　蛋白免疫印跡法分析結(jié)果證明，與Control組比較，轉(zhuǎn)染REC8過表達(dá)質(zhì)粒48h后，在HepG2、HuH-7、BEL-7402三種肝癌細(xì)胞中VEGF-C表達(dá)均上調(diào)(P<0.01)，表明在肝癌細(xì)胞系中，過表達(dá) REC8增加肝癌細(xì)胞的血管生成能力。小管形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，與Control組比較，轉(zhuǎn)染REC8過表達(dá)質(zhì)粒48h后， HepG2、HuH-7、BEL-7402三種

18、肝癌細(xì)胞對血管形成能力增加(P<0.01)，過表達(dá) REC8增加肝癌細(xì)胞的血管生成能力。
　　第三部分：REC8通過PKA通路促進(jìn)肝癌細(xì)胞的遷移侵襲及血管生成
　　目的：
　　通過免疫共沉淀聯(lián)合質(zhì)譜分析篩選與REC8相互作用的靶蛋白，探討REC8促進(jìn)肝癌細(xì)胞遷移侵襲及血管生成的作用機(jī)制。
　　方法：
　　通過免疫共沉淀以及細(xì)胞免疫熒光染色的方法驗(yàn)證REC8與靶蛋白的相互作用。在過表達(dá)REC8后應(yīng)用靶蛋白抑制

19、劑干預(yù)肝癌細(xì)胞系并應(yīng)用蛋白免疫印跡法檢測MMP-9、VEGF-C的表達(dá)、Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)、小管形成實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其功能。
　　結(jié)果：
　　1.在肝癌細(xì)胞中REC8與PKA RII-α存在相互作用
　　通過免疫共沉淀聯(lián)合質(zhì)譜分析后篩選與REC8相互作用的靶蛋白58個(gè)，其中PKA RII-α與細(xì)胞的遷移侵襲、血管形成關(guān)系密切。我們應(yīng)用免疫共沉淀進(jìn)行驗(yàn)證，沉淀產(chǎn)物以PKA RII-α抗體進(jìn)行蛋白免疫印跡法檢

20、測時(shí)出現(xiàn)陽性結(jié)果，提示PKA RII-α與REC8可能存在相互作用。應(yīng)用PKA RII-α抗體進(jìn)行沉淀，沉淀產(chǎn)物以REC8抗體進(jìn)行蛋白免疫印跡檢測出現(xiàn)陽性結(jié)果。我們進(jìn)一步應(yīng)用細(xì)胞免疫熒光染色檢測REC8與PKA RII-α是否存在相互作用，發(fā)現(xiàn)REC8染色定位于細(xì)胞核，PKA RII-α染色同時(shí)定位于細(xì)胞核，兩者間存在共定位，提示REC8與PKA RII-α存在相互作用。
　　2.在肝癌細(xì)胞中REC8通過與PKA RII-α作用使

21、PKA活性升高
　　蛋白免疫印跡法結(jié)果證明，過表達(dá)REC8后對PKA RII-α表達(dá)無明顯影響(P>0.05)。PKA活性測定結(jié)果顯示，過表達(dá)REC8后PKA活性升高(P<0.01)，表明在肝癌細(xì)胞系中，REC8促進(jìn)PKA活性上升。以上兩個(gè)結(jié)果提示REC8通過與PKA RII-α作用使PKA活性上升但不影響其表達(dá)。
　　3.REC8通過PKA通路促進(jìn)肝癌細(xì)胞的遷移侵襲
　　蛋白免疫印跡法分析結(jié)果證明，過表達(dá)REC8后應(yīng)

22、用PKA抑制劑H89，肝癌細(xì)胞HuH-7中MMP-9表達(dá)下降(P<0.01)，表明在肝癌細(xì)胞系中，REC8通過PKA通路上調(diào)MMP-9的表達(dá)，從而促進(jìn)肝癌細(xì)胞的遷移侵襲。PKA抑制劑H89可抑制 REC8過表達(dá)誘導(dǎo)的遷移、侵襲(P<0.01)。Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)顯示REC8通過PKA通路影響肝癌細(xì)胞的侵襲能力。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)顯示REC8通過PKA通路影響肝癌細(xì)胞的遷移能力(P<0.01)。
　　4.REC8通過PKA通路促進(jìn)

23、肝癌細(xì)胞的血管生成
　　蛋白免疫印跡法分析結(jié)果證明，過表達(dá)REC8后應(yīng)用PKA抑制劑H89，肝癌細(xì)胞HuH-7中VEGF-C表達(dá)下降(P<0.01)，表明在肝癌細(xì)胞系中，REC8通過PKA通路上調(diào)VEGF-C的表達(dá)，從而促進(jìn)肝癌細(xì)胞的血管生成能力。小管形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，過表達(dá)REC8后應(yīng)用PKA抑制劑H89，肝癌細(xì)胞HuH-7對血管形成能力減低，表明在肝癌細(xì)胞系中，REC8通過PKA通路促進(jìn)肝癌細(xì)胞的血管生成。
　　結(jié)論：<