Dapper1在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用及機制研究.pdf

1、第一部分：Dapper1在肝細胞癌發(fā)生發(fā)展中的作用及機制研究
　　研究目的：
　　肝癌是一種臨床常見的惡性腫瘤，其病因復(fù)雜，惡性程度高，異質(zhì)性強，并且多數(shù)患者確診時已是晚期，往往預(yù)后不良。因此，從不同的分子水平和信號通路的異常表達對肝癌進行分子水平的區(qū)別有對于肝癌的個體化治療是至關(guān)重要的。肝細胞癌(Hepatocellular Carcinoma，HCC)的發(fā)生和發(fā)展過程中涉及到多個促癌信號的激活，Wnt/β-catenin

2、信號通路在調(diào)節(jié)肝癌細胞分化、增殖、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化和干細胞的更新中起到重要作用。HCC中第二常見的特定位點基因突變即為促癌基因β-catenin的突變，突變比例約占20％-40％，因此Wnt/β-catenin通路的激活被認(rèn)為是可能用來對HCC進行臨床分型的標(biāo)志之一。
　　Wnt通路的激活過程需要多種蛋白的共同參與，Wnt配體與受體FZD及其共受體LRP5或LRP6結(jié)合，募集腳手架蛋白DSH(Disshevelled，DSH)，該蛋

3、白使得LRP5或LRP6磷酸化，導(dǎo)致AXIN復(fù)合體被激活并大量募集到受體上。隨后AXIN被降解，β-catenin降解復(fù)合體也隨之解離，導(dǎo)致細胞質(zhì)中β-catenin聚集，游離的β-catenin可以移位到細胞核內(nèi)，與TCF/LEF家族轉(zhuǎn)錄因子集合，誘導(dǎo)下游靶基因的轉(zhuǎn)錄，從而產(chǎn)生一系列的生物學(xué)效應(yīng)。而Dapper(Dpr)則是作為能夠拮抗Wnt通路中腳手架蛋白DSH功能的一類蛋白被發(fā)現(xiàn)。Dpr的同源物包括Dpr1、Dpr2和Dpr3，編

4、碼人Dpr1的基因為DACT1，位于第14號染色體上。Dpr1在胚胎發(fā)育過程中可以調(diào)控Wnt信號通路，另有研究報道了其核轉(zhuǎn)運與核定位信號，證明Dpr1還可通過核漿穿梭在胞核和胞漿中以不同方式調(diào)控Wnt通路的活性。腫瘤領(lǐng)域的研究表明Dpr1在肝癌患者癌組織中呈現(xiàn)下調(diào)狀態(tài)，并且這種下調(diào)伴隨著胞漿中β-catenin的積累，然而Dpr1在肝臟中表達及其在肝細胞癌發(fā)生發(fā)展中的作用及其機制尚不明確，有待進一步研究探討。
　　自噬是細胞在基礎(chǔ)

5、條件和應(yīng)激下維持細胞穩(wěn)態(tài)的一種分解代謝方式，在肝臟正常生理機能維持和肝臟疾病的病理進展中起著重要的作用。自噬調(diào)節(jié)異常與病毒性肝病、非酒精性肝脂肪性變、酒精性肝病、肝纖維化、肝硬化以及肝癌密切相關(guān)。目前普遍認(rèn)為自噬在肝癌的進展過程中起著雙重作用，即自噬在腫瘤形成和腫瘤抑制這兩個過程中均有作用。目前研究表明自噬相關(guān)標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)對于肝細胞癌的診斷和治療方式的選擇具有一定的指導(dǎo)意義。
　　p62是自噬過程中重要的底物與接頭分子，在多種肝臟

6、疾病中可以觀察到p62的高表達，例如非酒精性脂肪肝、酒精性脂肪肝、肝細胞癌等。大量報道表明p62可以通過調(diào)控NRF2信號通路、NF-κB信號通路、mTORC1信號通路、自噬、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等在維持細胞穩(wěn)態(tài)和腫瘤發(fā)生發(fā)展中起到重要的作用。目前研究表明過表達p62誘導(dǎo)NRF2與mTORC1的激活以及c-Myc的表達，可以促進小鼠中肝細胞癌的起始。p62累積導(dǎo)致的NRF2瞬時性激活可以保護肝細胞免受氧化應(yīng)激及環(huán)境中毒素的損傷，然而自噬功能受損導(dǎo)致

7、的p62蓄積和持續(xù)的NRF2激活則會導(dǎo)致肝癌的形成。因此，如何通過藥理學(xué)研究開發(fā)抑制p62累積及NRF2和mTORC1持續(xù)激活的制劑是將來研究抗HCC藥物的一個突破點。
　　近期研究表明Dpr1也具有調(diào)控細胞自噬的作用，研究表明在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中Dapper1可以通過促進Beclin1-Vps34-Atg14L復(fù)合體的形成促進自噬。在前期預(yù)實驗中我們在體內(nèi)和體外實驗中均發(fā)現(xiàn)Dpr1與自噬水平呈現(xiàn)負(fù)相關(guān);且在肝細胞特異性敲除Dpr1的

8、小鼠DEN誘癌模型中，Dpr1敲除的小鼠肝癌成瘤性顯著增強。
　　Dpr1調(diào)節(jié)Wnt信號通路的機制已得到較完善的闡釋，然而在肝細胞癌背景下Dpr1是否影響肝細胞癌的發(fā)生發(fā)展，是否調(diào)節(jié)Wnt信號通路或影響肝臟細胞自噬水平的變化，以及上述通路變化對肝癌發(fā)生發(fā)展的作用均有待進一步研究探討?；谝陨媳尘埃菊n題旨在探討Dpr1在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用，相關(guān)信號通路變化及其下游效應(yīng)，進而評估Dpr1作為肝癌臨床診斷、預(yù)后判斷標(biāo)志物和治療靶點的

9、潛在價值。
　　研究方法：
　　1.通過RT-PCR檢測肝細胞癌患者中Dpr1的表達量，初步探討Dpr1表達量在肝癌形成中的作用。
　　2.將Alb-Cre小鼠與Dpr1-Loxp小鼠雜交，鑒定肝細胞特異性敲除Dpr1的小鼠。利用腹腔注射DEN與CCl4誘導(dǎo)小鼠肝細胞癌，收集誘癌過程中（誘癌1.5月、2月、2.5月及3月）小鼠肝臟樣本，誘癌4個月觀察小鼠肝臟腫瘤形成情況，初步確定Dpr1在肝癌形成過程中的作用，并比較與

10、肝癌患者中的觀察是否一致。
　　3.RT-PCR檢測肝癌細胞系中Dpr1表達情況，選擇Dpr1低表達的細胞系Huh7及LM3通過慢病毒體系構(gòu)建Dpr1穩(wěn)定過表達細胞系。利用該細胞系進行裸鼠皮下荷瘤實驗,觀察Dpr1過表達細胞與對照細胞成瘤的差異，進一步明確Dpr1對于腫瘤形成的影響。
　　4.分離Dact1hep-/-小鼠與WT小鼠肝臟原代細胞，通過Western Blot檢測原代細胞中自噬相關(guān)分子(p62及LC3-Ⅱ等)表

11、達量。同時在上述穩(wěn)定過表達Dpr1細胞系中檢測自噬相關(guān)分子的表達;用Ad-GFP-RFP-LC3Ⅱ監(jiān)測自噬流的變化，并對自噬小體及自噬溶酶體進行計數(shù)，統(tǒng)計其相對值，明確Dpr1過表達及敲除后對自噬的影響;在培養(yǎng)體系中去血清饑餓培養(yǎng)誘導(dǎo)細胞自噬，明確饑餓誘導(dǎo)條件下Dpr1對自噬的影響。
　　5.在上述DEN誘導(dǎo)肝細胞癌各個時間點的Dact1 hep-/-小鼠與WT小鼠肝臟樣本中檢測自噬相關(guān)分子的表達，探討在肝細胞癌形成過程中Dpr1

12、對自噬的影響以及與肝細胞癌形成的關(guān)系。
　　6.檢測上述穩(wěn)定表達Dpr1細胞系及原代分離的Dact1hep-/-小鼠與WT小鼠肝細胞在H2O2誘導(dǎo)下細胞衰老表型的差異;利用ROS試劑盒檢測上述穩(wěn)定表達Dpr1細胞系及Dact1 hep-/-與WT小鼠原代細胞中ROS的生成并進行標(biāo)準(zhǔn)化量化。
　　7.檢測上述DEN誘導(dǎo)肝細胞癌各個時間點的Dact1hep-/-小鼠與WT小鼠肝臟新鮮組織冰凍切片中細胞衰老情況，探討在腫瘤形成過程

13、中Dpr1對細胞衰老的關(guān)系;通過RT-PCR及Western Blot檢測衰老相關(guān)分子p53、p21、p16等的表達量，明確Dpr1影響細胞衰老的上游信號通路。
　　8.檢測上述DEN誘導(dǎo)肝細胞癌各個時間點的Dact1 hep-/-小鼠與WT小鼠DNA損傷修復(fù)關(guān)鍵分子的表達，明確Dpr1在肝細胞癌形成過程中對DNA損傷的影響;通過免疫組織化學(xué)檢測肝癌癌前病變，高度不典型增生結(jié)節(jié)標(biāo)志性分子，觀察Dpr1在腫瘤形成前期對癌前病變形成的

14、作用。
　　9.收集Dact1 hep-/-小鼠與WT小鼠DEN加CCl4誘導(dǎo)肝細胞癌2月的新鮮樣本，固定后電鏡觀察兩組小鼠自噬小體形成，線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細胞器形態(tài)及糖原累積情況等變化。
　　10.通過Western Blot檢測DEN誘導(dǎo)肝細胞癌各個時間點肝臟樣本中與自噬、細胞衰老及DNA損傷相關(guān)上游通路的關(guān)鍵分子，例如p-Akt信號通路，p62-Nrf2信號通路等。
　　11.通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染在293T中過表達Dpr1

15、，以及利用Dact1 hep-/-小鼠與WT小鼠原代細胞，觀察Dpr1對PTEN降解的調(diào)節(jié)及其機制。
　　12.利用IP等方法探討Dpr1與自噬等信號通路中關(guān)鍵分子相互作用的可能性，并利用后續(xù)敲除或過表達實驗進行功能驗證，觀察其對上述自噬、衰老、DNA損傷應(yīng)答等表型的影響。
　　研究結(jié)果：
　　1.通過RT-PCR檢測44例肝細胞癌患者肝癌及癌旁組織樣本中Dpr1的表達量，與癌旁組織相比，肝癌組織中Dpr1呈現(xiàn)低表達。

16、
　　2.Dact1hep-/-小鼠與WT小鼠進行DEN加CCl4誘導(dǎo)肝細胞癌4個月，發(fā)現(xiàn)Dact1hep-/-小鼠肝臟成瘤數(shù)目明顯多于對照小鼠，說明Dpr1敲除后促進小鼠肝臟腫瘤形成，與肝癌患者中觀察一致。
　　3.利用慢病毒體系建立MHCC-LM3及Huh7過表達Dpr1及GFP細胞系進行裸鼠皮下荷瘤，4周后發(fā)現(xiàn)過表達Dpr1組皮下腫瘤明顯小于對照組，表明Dpr1抑制腫瘤的形成。
　　4.Western Blot檢

17、測穩(wěn)定細胞系中自噬相關(guān)分子p62，LC3-Ⅱ的表達，發(fā)現(xiàn)過表達Dpr1后，細胞自噬水平升高，而原代分離的Dact1hep-/-肝細胞中自噬水平顯著低于WT小鼠肝細胞;利用Ad-RFP-GFP-LC3-Ⅱ系統(tǒng)檢測自噬流也提示隨著Dpr1表達量升高，自噬溶酶體/自噬小體比例明顯增高，提示自噬能力增強。去血清培養(yǎng)誘導(dǎo)細胞自噬也發(fā)現(xiàn)饑餓誘導(dǎo)后Dpr1過表達細胞自噬能力的增強高于對照組。
　　5.利用Western Blot檢測DEN誘導(dǎo)肝

18、細胞癌各個時間點Dact1 hep-/-小鼠與WT小鼠肝臟樣本中自噬相關(guān)分子的表達，發(fā)現(xiàn)Dact1 hep-/-小鼠肝臟樣本中p62表達高于對照組而LC3-Ⅱ表達量較低，說明誘導(dǎo)肝細胞癌發(fā)生的過程中，Dact1hep-/-小鼠肝臟自噬水平均較對照組更低。
　　6.穩(wěn)定表達Dpr1的肝癌細胞系中利用β-gal染色檢測細胞衰老，實驗發(fā)現(xiàn)Dpr1過表達Huh7肝癌細胞系，衰老細胞比例明顯多于對照細胞;而原代分離的Dact1hep-/-小

19、鼠肝細胞中本底情況下衰老細胞比例則少于對照組;原代細胞培養(yǎng)體系中加入H2O2誘導(dǎo)氧化應(yīng)激及衰老，WT原代肝細胞中隨H2O2濃度增高，細胞衰老比例呈增加趨勢，而Dacthep-/-細胞中誘導(dǎo)細胞衰老效果并不顯著。利用MitoSOX RED檢測細胞中ROS的含量，Dpr1過表達細胞系中ROS含量均明顯高于對照組;而原代分離Dpr1hep-/-小鼠肝細胞中ROS含量則明顯低于WT小鼠肝細胞;以上表明Dpr1誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生，可能是導(dǎo)致細胞衰老的

20、原因之一。
　　7.利用β-gal染色檢測上述DEN誘導(dǎo)肝細胞癌各個時間點的Dact1 hep-/-小鼠與WT小鼠肝臟新鮮組織冰凍切片中細胞衰老，Dact1 hep-/-小鼠肝細胞中幾乎并未觀察到β-gal陽性染色，而WT小鼠DEN誘癌2月和3月肝臟組織中則出現(xiàn)大量細胞衰老;DEN誘癌4月形成的腫瘤組織中，兩組小鼠均未見明顯衰老陽性細胞。RT-PCR檢測原代分離Dact1hep-/-小鼠與WT小鼠肝細胞p53與p21的表達，結(jié)果提

21、示W(wǎng)T小鼠肝細胞中p53與p21的表達均略高于Dact1hep-/-小鼠。Western Blot檢測DEN誘導(dǎo)肝癌過程不同時間點樣本中p53及p21的表達，也發(fā)現(xiàn)WT小鼠肝臟組織中p53與p21表達高于Dact1hep-/-小鼠。
　　8.利用Western Blot檢測上述DEN誘癌不同時間點Dact1hep-/-小鼠與WT小鼠石蠟樣本切片中DNA損傷關(guān)鍵分子的表達，發(fā)現(xiàn)Dact1 hep-/-小鼠樣本中p-p53、γ-H2A

22、X等DNA損傷標(biāo)志物表達量顯著高于對照組。通過HE及免疫組織化學(xué)檢測DEN誘導(dǎo)肝細胞癌3個月的小鼠肝臟樣本中肝癌前病變標(biāo)志物，發(fā)現(xiàn)Dact1 hep-/-小鼠肝臟樣本中 HGDN數(shù)量顯著多于對照組小鼠。
　　9.電鏡觀察DEN誘癌2月Dact1 hep-/-小鼠及對照小鼠樣本，發(fā)現(xiàn)Dact1hep-/-小鼠組織中自噬小體數(shù)量明顯少于對照組，且觀察到明顯糖原累積及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹。
　　10.檢測DEN誘導(dǎo)肝細胞癌模型各個時間點Da

23、ct1 hep-/-小鼠與WT小鼠組織樣本中p-Akt相關(guān)通路變化，發(fā)現(xiàn)Dact1hep-/-小鼠樣本中p-Akt信號通路明顯激活，且PTEN表達量出現(xiàn)下調(diào)。
　　11.在293T細胞中梯度過表達Dpr1后可以檢測到PTEN表達隨Dpr1梯度增加呈現(xiàn)表達升高趨勢。293T中過表達Dpr1-myc及對照質(zhì)粒后加入CHX抑制蛋白合成，發(fā)現(xiàn)PTEN降解在Dpr1過表達細胞中減慢。
　　12.293T中同時過表達PTEN-His、H

24、A-Ubiquitin、Dpr1-myc作為實驗組，PTEN-His、HA-UB、Pll-GFP作為對照組，IP實驗發(fā)現(xiàn)Dpr1過表達細胞中His-tag抗體可以成功捕獲HA-UB，表明Dpr1過表達后出現(xiàn)泛素化PTEN的累積，可能由于其降解能力減弱所致。
　　結(jié)論：
　　在DEN誘導(dǎo)肝細胞癌模型中，Dact1hep-/-小鼠肝細胞癌成瘤能力顯著高于WT小鼠，提示在該模型中Dpr1對于肝癌形成具有抑制作用。對肝癌患者癌及癌旁

25、樣本檢測發(fā)現(xiàn)，Dpr1在肝癌患者癌組織中低表達，進而明確了Dpr1的抑癌作用。體外實驗檢測Dact1 hep-/-小鼠及WT小鼠原代肝細胞以及Dpr1穩(wěn)定過表達及對照肝癌細胞系發(fā)現(xiàn)，Dpr1干擾后細胞自噬水平顯著降低，細胞衰老減慢且DNA損傷加重，以上生物學(xué)過程的改變在DEN誘癌過程中共同導(dǎo)致Dact1hep-/-小鼠肝細胞成瘤性增強。進一步的機制探討發(fā)現(xiàn)Dact1 hep-/-小鼠成瘤過程中PTEN表達量下調(diào)同時p-Akt信號通路活性

26、增強。研究表明Dpr1過表達細胞中出現(xiàn)明顯的泛素化PTEN堆積，提示PTEN降解速率減慢，Dpr1可能參與PTEN穩(wěn)定性的調(diào)節(jié)。這一效應(yīng)可能是由于肝細胞自噬受阻后p62介導(dǎo)泛素化PTEN降解減慢所致，具體機制仍需后期實驗驗證。我們還將通過Dpr1截斷體探索其作用的具體位點，闡釋Dpr1作用于PTEN的具體分子機制，探討其對肝癌治療及預(yù)后判斷潛在的作用。
　　第二部分HBx調(diào)節(jié)HMGBl分泌促進肝細胞癌進展的作用及機制研究
　

27、　研究目的：
　　肝細胞癌CHCC)是最為常見的腫瘤之一，在腫瘤導(dǎo)致的死亡中位居第三。乙型病毒性肝炎病毒(HBV)感染是公認(rèn)的HCC的主要危險因子。HBV感染可以引起肝炎-肝纖維化-肝硬化的進展，最終導(dǎo)致肝細胞癌的發(fā)生。肝細胞癌患者通常預(yù)后不良，而腫瘤肝內(nèi)轉(zhuǎn)移以及遠端轉(zhuǎn)移是影響預(yù)后的重要因素。在HBV引起的肝癌患者中接受肝切除術(shù)后仍然可能伴有HBV的活化，HBV活性的持續(xù)同樣影響患者的預(yù)后。有資料表明持續(xù)的抗病毒治療可以有效延長患

28、者的生存期，而術(shù)后抗病毒治療也有望減輕病毒的負(fù)載，緩解肝臟炎性反應(yīng)，進而提高患者術(shù)后生存率。
　　HBV基因組DNA由4段部分重疊的開放閱讀框構(gòu)成，其中X區(qū)域編碼HBVx蛋白(HBx),HHx蛋白是一段17kd大小的可溶性蛋白，在宿主細胞的胞核和胞漿廣泛分布，在HBV導(dǎo)致的肝癌進展中發(fā)揮著重要的作用。一方面，HBx通過促進細胞增殖以及遷移促進肝細胞癌的發(fā)生與發(fā)展。另外，HBx還可影響轉(zhuǎn)錄因子活性，上調(diào)RaslRaf/MAPK，PI

29、3K/Akt等關(guān)鍵信號通路活性促進肝癌的進展。然而，HBx與肝癌發(fā)生發(fā)展的具體分子機制卻仍未被完全闡明。
　　HMGB1作為一種進化上相對保守的染色體結(jié)合蛋白被發(fā)現(xiàn)，早期報道表明其作為DNA的分子伴侶發(fā)揮增強染色體穩(wěn)定性的作用。近年來的報道表明，HMGB 1不僅可以作為敗血癥晚期系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)因子，而且在肝臟缺血再灌注損傷早期被分泌到細胞外而發(fā)揮作用。同時，HMGB1與一些惡性腫瘤的預(yù)后不良相關(guān)，例如肝細胞癌，前列腺癌、乳腺

30、癌、結(jié)腸癌等。在缺氧的腫瘤微環(huán)境下，肝癌細胞可以釋放HMGB1,從而引起下游的炎癥級聯(lián)反應(yīng)，從而促進肝癌的侵襲與轉(zhuǎn)移。
　　因此，本課題旨在探討HBx促進肝癌侵襲和轉(zhuǎn)移的具體分子機制以及HMGB1在其中的介導(dǎo)作用。根據(jù)本課題組前期的文獻閱讀和預(yù)實驗基礎(chǔ)，提出以下假設(shè):HBx通過促進肝細胞癌細胞分泌HMGB1，引起下游級聯(lián)免疫反應(yīng)從而促進肝癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，加速肝癌進展。本課題將首先驗證此猜想的科學(xué)性，進而深入探討HBx促進肝癌細

31、胞分泌HMGB 1的具體分子機制。HMGB1在患者血清及肝組織的水平或可作為預(yù)測肝癌患者預(yù)后的指標(biāo)，同時利用HMGB1中和抗體封閉HMGB1的活性或可作為乙肝相關(guān)肝癌患者潛在的治療策略。因此本課題關(guān)于HBx促進促進肝細胞癌細胞分泌HMGB1的作用及機制研究可為臨床肝癌患者的分子分型及個體化治療提供新的依據(jù)。
　　研究方法：
　　1.收集肝細胞癌患者肝癌與癌旁組織，制作組織芯片，利用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測芯片中組織HMGB 1的

32、表達情況，利用組織染色評分軟件對胞漿中HMGB 1染色進行評分。整理上述組織芯片中患者的臨床資料以及隨訪預(yù)后資料，根據(jù)HMGB1胞漿著色評分的中位數(shù)，將患者分為HMGB1胞漿高表達組(評分高于中位數(shù))和低表達組(評分低于中位數(shù))，結(jié)合患者總體生存期，復(fù)發(fā)時間等進行患者預(yù)后分析，明確HMGB I與肝癌患者的預(yù)后關(guān)系;結(jié)合患者的臨床資料進行生存和復(fù)發(fā)的單因素及多因素分析;分析患者胞漿HMGB1染色與HBV DNA滴度之間的關(guān)系。
　　

33、2.選取不同HBV DNA滴度的肝癌患者，根據(jù)HBV復(fù)制活躍程度分組:HBV DNA>lOSIU/mL; 103　　3.用RTPCR檢測肝癌患者組織樣本中HBx的表達水平，將該樣本進行核漿分離，利用We

34、stern Blot檢測HMGB1在胞漿中的表達量并進行灰度定量，統(tǒng)計學(xué)分析肝癌患者胞漿中HMGB1表達與組織中HBx表達量之間的相關(guān)性。
　　4.利用慢病毒體系建立肝細胞癌細胞系過表達HBx及對照質(zhì)粒的穩(wěn)定細胞系，利用ELISA和Western Blot檢測細胞培養(yǎng)上清中HMGB1的分泌水平及時間依賴性。
　　5.利用腺病毒系統(tǒng)感染肝細胞癌細胞系，建立短時的過表達HBx及對照GFP的模型，利用ELISA和Western B

35、lot檢測細胞培養(yǎng)上清中HMGB1的分泌水平及時間依賴性；在上述建立的穩(wěn)定過表達HBx及對照的肝癌細胞系中，利用細胞免疫熒光技術(shù)觀察過表達HBx后是否存在HMGB1的胞漿轉(zhuǎn)位。
　　6.通過Transwell技術(shù)檢測肝癌細胞系的侵襲性，在培養(yǎng)體系中加入重組HMGB1蛋白，或HMGB 1中和抗體封閉分泌型HMGB 1活性后，觀察肝癌細胞系侵襲性的變化。
　　7.利用慢病毒系統(tǒng)建立構(gòu)建過表達HBx-Luc及GFP-Luc的肝癌細

36、胞系，NOD-SCID小鼠尾靜脈注射上述表達熒光素酶的細胞系建立肺轉(zhuǎn)移模型，定期通過小動物活體成像系統(tǒng)觀察小鼠腫瘤細胞肺轉(zhuǎn)移的情況，比較兩組細胞系的肺轉(zhuǎn)移特性;給予PBS或者HMGB 1中和抗體進行干預(yù)性治療，比較各組小鼠活體成像信號強弱;處死各組小鼠后，比較大體肺轉(zhuǎn)移瘤大小及個數(shù)，收集各組小鼠肺組織樣本;對小鼠肺組織進行HE染色，計數(shù)各組小鼠肺中微轉(zhuǎn)移灶的數(shù)目;同時對肺組織進行免疫組織化學(xué)染色，觀察各組HMGB 1染色情況，比較HBx

37、過表達組與對照組中胞漿內(nèi)HMGB1的表達量，對比HMGB1中和抗體處理之后，胞漿中HMGB1染色的變化。
　　8.利用細胞內(nèi)游離鈣離子特異性探針，比較HBx過表達穩(wěn)定細胞系及對照細胞系中細胞內(nèi)游離鈣離子的含量。給予鈣離子拮抗劑BAPTA-AM處理細胞系后，比較細胞培養(yǎng)上清中HMGB1的濃度，細胞內(nèi)游離鈣離子濃度的變化以及用Transwell檢測細胞的侵襲性。
　　9.在上述小鼠尾靜脈肺轉(zhuǎn)移模型中，給予PBS或者BAPTA-A

38、M進行治療性干預(yù)，活體成像系統(tǒng)觀察小鼠肺轉(zhuǎn)移瘤形成情況;定期取各組小鼠血清，檢測血清中HMGB1的濃度;處死小鼠后比較小鼠肺上轉(zhuǎn)移瘤的數(shù)目和大小;對小鼠肺組織進行HE染色，比較各組中肺上微轉(zhuǎn)移灶的數(shù)目;對小鼠肺組織進行HMGB 1細胞免疫化學(xué)染色，比較轉(zhuǎn)移灶中胞漿內(nèi)HMGB1的分泌。
　　10.在穩(wěn)定表達HBx的細胞系及腺病毒感染HBx或者對照病毒的細胞系中，培養(yǎng)體系中加入鈣離子相關(guān)通路的抑制劑，收集細胞培養(yǎng)上清用ELISA檢測H

39、MGB1的分泌量;利用Transwell體系，檢測加入抑制劑后兩組細胞的侵襲性變化；通過上述方法明確HBx調(diào)節(jié)HMGB1分泌所涉及的鈣離子相關(guān)性通路。
　　研究結(jié)果：
　　1.肝癌細胞SMMC-7721及MHCC-LM3過表達HBx后，細胞培養(yǎng)上清中HMGB1分泌明顯高于對照組，細胞免疫熒光可觀察到明顯的HMGB1胞漿轉(zhuǎn)位，提示HBx促進HMGB1的分泌。
　　2.肝癌細胞SMMC-7721及MHCC-LM3培養(yǎng)體系中

40、加入重組HMGB1蛋白后，細胞侵襲性明顯增強;肝癌細胞系過表達HBx后，細胞穿膜能力明顯增強，而在Transwell體系中加入HMGB1中和抗體后，細胞侵襲性明顯減弱到與對照組相似的水平。
　　3.在小鼠尾靜脈注射肝癌細胞系肺轉(zhuǎn)移模型中，注射HBx組細胞系小鼠肺活體成像信號明顯強于對照組;定期眼球后取血檢測血清中HMGB 1濃度，發(fā)現(xiàn)注射HBx過表達組細胞系的小鼠血清中HMGB 1水平更高;給予HMGB 1中和抗體干預(yù)后，注射HB

41、x過表達組小鼠肺部活體成像信號明顯減弱，處死小鼠后肺轉(zhuǎn)移瘤大小和數(shù)目均明顯低于PBS組；肺組織HE染色中，使用HMGB1中和抗體治療組小鼠肺部微轉(zhuǎn)移灶數(shù)量明顯少于對照HBx組小鼠，同時HMGB1免疫組織化學(xué)染色中胞漿著色減弱至類似于注射GFP組細胞的水平。以上提示:在體內(nèi)實驗中，阻斷HMGB 1的活性可以有效減輕HBx過表達肝癌細胞系的轉(zhuǎn)移。
　　4.在過表達HBx及對照質(zhì)粒的肝癌細胞系中加入細胞內(nèi)鈣離子拮抗劑，可以有效抑制細胞培

42、養(yǎng)上清中HMGB1的分泌并且伴隨細胞侵襲能力的減弱;體內(nèi)實驗肺轉(zhuǎn)移模型中，給予BAPTA-AM干預(yù)后，小鼠肺轉(zhuǎn)移瘤形成明顯減少，胞漿內(nèi)HMGB1水平也呈現(xiàn)下降趨勢。以上提示HBx促進HMGB1的分泌從而影響腫瘤細胞的侵襲轉(zhuǎn)移依賴于細胞內(nèi)游離鈣離子濃度的升高。
　　5.在過表達HBx及對照質(zhì)粒的肝癌細胞系中加入CAMKK及CAMKIV抑制劑，可以 有效抑制細胞培養(yǎng)上清中HMGB 1的分泌，同時可觀察到HBx過表達組細胞侵襲性下降。提

43、示HBx調(diào)節(jié)HMGB 1分泌是通過Cat+-CAMKK-CAMKIV通路介導(dǎo)的。
　　6.肝癌患者組織芯片進行HMGB 1免疫組織化學(xué)染色及胞漿HMGB 1著色評分，根據(jù)評分中位數(shù)將患者分為HMGB 1高表達組及HMGB 1低表達組，生存分析發(fā)現(xiàn)HMGB 1高表達提示患者預(yù)后不良。同時，肝癌患者血清學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)血清中HMGB 1 水平與患者HBV DNA滴度呈現(xiàn)正相關(guān)，與組織芯片中肝癌細胞胞漿中HMGB1水平與患者HBV滴度的相關(guān)性

44、分析結(jié)果一致。
　　結(jié)論：本研究證實HBx蛋白通過Ca+-CAMKK-CAMKIV信號通路調(diào)節(jié)肝癌細胞中HMGB1的分泌，進而促進肝癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致肝癌患者預(yù)后不良。使用HMGB1中和抗體封閉HMGB1的作用或Ca+-CAMKK-CAMKIV通路的抑制劑均可以有效的抑制HBx促進的HMGB1的分泌，抑制肝癌細胞的轉(zhuǎn)移。肝癌患者血清HMGB1水平或可指導(dǎo)HBV相關(guān)肝癌患者預(yù)后判斷，抑制HMGB1分泌的干預(yù)性治療有望成為HBV相