Gankyrin介導(dǎo)的去分化在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用研究.pdf

1、第一部分，研究背景和目的：
　　 原發(fā)性肝癌是目前世界上最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率在惡性腫瘤中排名第六，死亡率則居第三。原發(fā)性肝癌中肝細(xì)胞癌是最常見的類型。肝細(xì)胞癌的發(fā)生機(jī)制較為復(fù)雜，主要包括各種致病因素(乙型/丙型肝炎病毒感染、酒精濫用、非酒精性脂肪肝等)引起的肝臟長(zhǎng)期慢性炎癥與硬化。肝細(xì)胞癌的高度異質(zhì)性導(dǎo)致難以單獨(dú)采用化療清除癌細(xì)胞，同時(shí)手術(shù)切除和肝移植也僅限于早期診斷的肝癌。由于大多數(shù)肝癌患者診斷時(shí)已是中晚期，并且術(shù)后

2、頻頻復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致肝癌患者的預(yù)后較差。肝癌的發(fā)病率高、死亡率高、并且缺乏有效的治療手段，因此研究肝癌發(fā)生的機(jī)制、探尋新的肝癌預(yù)防和治療靶點(diǎn)就顯得尤為重要。
　　 肝細(xì)胞去分化在肝癌進(jìn)展的過程中扮演著重要的作用。肝細(xì)胞癌是一個(gè)復(fù)雜的異質(zhì)物，其中包含著具有無限增殖潛能的未分化細(xì)胞群。近年來，隨著對(duì)去分化研究的不斷深入，通過誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞分化來治療肝癌已展現(xiàn)出一定的前景。評(píng)價(jià)肝癌的分化程度對(duì)于肝癌患者的病理診斷、治療策略的優(yōu)化選擇和預(yù)后

3、評(píng)估都很關(guān)鍵。
　　 肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)與代謝功能的維持受到一系列肝富集核因子的交叉調(diào)控，這些核因子又稱為肝細(xì)胞核因子(HNFs，Hepatocytenuclearfactors)，主要包括HNF1α、HNF3β和HNF4α等。在HNF家族中，HNF4α與肝細(xì)胞功能和分化狀態(tài)的維持有重要的聯(lián)系，也有研究顯示，在肝癌細(xì)胞中過表達(dá)HNF4α，可以在一定程度上誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞向肝細(xì)胞分化。
　　 癌基因p28GANK，又名Gankyrin

4、，也叫做26S蛋白酶體非ATP酶亞基10(PSMD10)，最初發(fā)現(xiàn)在肝癌中特異高表達(dá)。隨著對(duì)Gankyrin研究的不斷深入，陸續(xù)發(fā)現(xiàn)它在肺癌、結(jié)腸癌等其他類型的惡性腫瘤中也存在高表達(dá)。前期研究發(fā)現(xiàn)Gankyrin可以與CDK4相互作用促進(jìn)抑癌蛋白R(shí)b的降解；Gankyrin也可以與MDM2直接結(jié)合從而促進(jìn)MDM2依賴的p53泛素化和降解。近期研究顯示，Gankyrin可以通過調(diào)控RhoA/ROCK信號(hào)通路促進(jìn)腫瘤發(fā)生；另一方面，在DEN

5、誘導(dǎo)的小鼠肝癌模型中，Gankyrin通過促進(jìn)C/EBPα泛素化降解促進(jìn)肝癌的發(fā)生；另外本實(shí)驗(yàn)室的研究也發(fā)現(xiàn)Gankyrin可以與RelA結(jié)合抑制NF-κB的活性；Gankyrin也能通過活化PI-3K/Akt/HIF1α通路促進(jìn)Twist1、VEGF、MMP2的表達(dá)，從而使肝癌細(xì)胞發(fā)生EMT，促進(jìn)肝癌的侵襲轉(zhuǎn)移，影響肝癌病人的預(yù)后。而Gankyrin的表達(dá)與肝癌去分化之間的關(guān)系尚不清楚。因此，本課題研究Gankyrin與肝癌去分化之間

6、的關(guān)系及可能的分子機(jī)制，有助于解釋肝癌的發(fā)病機(jī)理，并為肝癌的分化治療提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。
　　 研究方法：
　　 1.建立大鼠DEN肝癌誘導(dǎo)模型，收集不同病變階段的大鼠肝臟標(biāo)本
　　 2.建立小鼠CCl4急性肝損傷模型
　　 3.采用Western-blot、Realtime-PCR、免疫組化等方法研究上述動(dòng)物模型中Gankyrin及相關(guān)分化指標(biāo)表達(dá)的變化
　　 4.在臨床肝癌樣本中利用免疫組化、Rea

7、ltime-PCR等方法，研究Gankyrin與去分化指標(biāo)之間的關(guān)系
　　 5.構(gòu)建Gankyrin相關(guān)的干擾及過表達(dá)質(zhì)粒，包裝腺病毒和慢病毒，建立穩(wěn)定細(xì)胞系
　　 6.建立大鼠原代肝細(xì)胞分離模型，分離原代肝細(xì)胞并離體培養(yǎng)，用Gankyrin相關(guān)腺病毒進(jìn)行刺激，研究Gankyrin誘導(dǎo)肝細(xì)胞去分化的作用
　　 7.利用CCK8、流式、克隆形成、裸鼠荷瘤等方法，檢測(cè)Gankyrin相關(guān)肝癌穩(wěn)定細(xì)胞系的惡性表型變化<

8、br>　　 8.采用Realtime-PCR、流式、免疫組織熒光、Spheroid形成實(shí)驗(yàn)等方法檢測(cè)臨床樣本和肝癌穩(wěn)定細(xì)胞系肝癌干細(xì)胞表型的變化
　　 9.利用免疫共沉淀、免疫組化等方法研究Gankyrin對(duì)肝細(xì)胞核因子的調(diào)控作用及機(jī)制
　　 研究結(jié)果：
　　 1.在CCl4誘導(dǎo)的小鼠急性肝纖維化-硬化模型中發(fā)現(xiàn)Gankyrin的表達(dá)增加；在大鼠DEN肝癌誘導(dǎo)模型中，Gankyrin的表達(dá)隨著病變程度的加重而不

9、斷升高，并且與去分化相關(guān)指標(biāo)的變化趨勢(shì)一致
　　 2.Gankyrin在臨床樣本中的表達(dá)與肝癌組織的分化程度負(fù)相關(guān)
　　 3.Gankyrin可以在體外誘導(dǎo)原代大鼠肝細(xì)胞去分化
　　 4.干擾肝癌細(xì)胞系中Gankyrin的表達(dá)可以抑制其惡性表型，誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞分化，并減少干擾細(xì)胞系裸鼠皮下荷瘤成瘤
　　 5.干擾Gankyrin表達(dá)可以抑制肝癌干細(xì)胞表型
　　 6.Gankyrin通過誘導(dǎo)HNF4α

10、的降解促進(jìn)了肝細(xì)胞和肝癌細(xì)胞的去分化，這種調(diào)控作用在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和臨床標(biāo)本中均得到了證實(shí)
　　 結(jié)論：
　　 本課題從細(xì)胞、動(dòng)物等不同水平證實(shí)了Gankyrin在肝癌發(fā)生、發(fā)展的過程中發(fā)揮了重要的作用。我們的研究發(fā)現(xiàn)Gankyrin在肝癌發(fā)生過程中表達(dá)逐漸增強(qiáng)；肝癌中Gankyrin的表達(dá)與分化程度負(fù)相關(guān)；Gankyrin可以通過誘導(dǎo)HNF4α降解引起去分化從而促進(jìn)肝癌的發(fā)生發(fā)展；通過慢病毒介導(dǎo)的microRNA干擾Gank

11、yrin，可以有效地誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞分化、抑制肝癌干細(xì)胞表型、使干擾細(xì)胞系裸鼠荷瘤成瘤減少。Gankyrin誘導(dǎo)去分化的創(chuàng)新性研究進(jìn)一步完善了Gankyrin的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，也為臨床應(yīng)用Gankyrin相關(guān)抑制劑進(jìn)行分化治療和靶向治療提供了思路和依據(jù)。
　　 第二部分，研究背景和目的：
　　 肝癌是最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率長(zhǎng)期居高不下。我國(guó)是世界上肝癌發(fā)病最多的國(guó)家，每年新發(fā)病例約占全球的50％。目前肝癌的治療仍以

12、手術(shù)治療為主，但肝癌發(fā)病隱匿，相當(dāng)一部分病人發(fā)現(xiàn)時(shí)已是中晚期，失去了手術(shù)時(shí)機(jī)；我國(guó)還有很多肝癌病人經(jīng)歷了長(zhǎng)期的肝硬化病程，全身狀況差，不能承受外科治療；另外，由于尚無有效的化療藥物，大量肝癌病人外科手術(shù)后復(fù)發(fā)，二次手術(shù)難度大、風(fēng)險(xiǎn)高。因此，肝癌的預(yù)防和治療一直我國(guó)醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)問題。肝癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多階段的復(fù)雜過程，已有的研究已經(jīng)報(bào)道了多種癌基因、生長(zhǎng)因子等異常表達(dá)與肝癌細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化和侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)。但目前為止，尚未發(fā)現(xiàn)一個(gè)理想

13、的預(yù)防或治療肝癌的干預(yù)靶點(diǎn)。另外，由于肝癌術(shù)后極易復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，傳統(tǒng)的臨床預(yù)后指標(biāo)存在明顯的局限性。由此，闡明肝癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，尋找相關(guān)標(biāo)志物和干預(yù)靶點(diǎn)是當(dāng)前肝癌研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)。
　　 真核細(xì)胞中含有大量的蛋白質(zhì)，在生物體的生命周期中，各種蛋白質(zhì)均處于持續(xù)動(dòng)態(tài)更新(turnover)的平衡狀態(tài)，蛋白質(zhì)的合成與降解處于同等重要的地位。在以往的研究中，很多工作都致力于研究細(xì)胞怎樣調(diào)控特定蛋白質(zhì)的合成，而對(duì)其降解機(jī)制研究則較少，然

14、而，越來越多的證據(jù)表明，蛋白質(zhì)的降解途徑是一個(gè)耗能的，有序的過程，而且受到精細(xì)復(fù)雜的調(diào)控，其中很多關(guān)鍵分子與其他信號(hào)通路還存在交互作用(cross-talk)。該系統(tǒng)參與了很多細(xì)胞生物學(xué)行為的調(diào)節(jié)，并與許多疾病包括腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。因此研究蛋白降解系統(tǒng)的調(diào)控及意義已成為醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的一個(gè)熱點(diǎn)，其中某些關(guān)鍵的調(diào)控分子可能成為疾病治療的靶標(biāo)，部分靶向蛋白降解系統(tǒng)的藥物和治療方案已經(jīng)進(jìn)入應(yīng)用開發(fā)階段。
　　 細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)主要通過兩

15、種不同的途徑降解：溶酶體(lysosome)途徑和泛素-蛋白酶系統(tǒng)(Theubiquitin-proteasomesystem，UPS))途徑，其中，溶酶體主要降解細(xì)胞膜上的蛋白，但也可通過自噬途徑，降解某些胞漿中的蛋白。相比之下，泛素-蛋白酶體途徑則能夠高選擇性地降解細(xì)胞漿中的可溶性蛋白，對(duì)細(xì)胞正常生理功能的維持具有十分重要的意義。近來研究發(fā)現(xiàn)，蛋白泛素化、去泛素化的異常和多種腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，癌基因和抑癌基因產(chǎn)物的降解異常在很多惡

16、性腫瘤中都存在。一方面，某些癌基因和抑癌基因的泛素化降解失控，會(huì)導(dǎo)致癌蛋白的異常富集和抑癌蛋白的減少，最終增加腫瘤發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)；另一方面，本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，26s蛋白酶體的19s調(diào)節(jié)復(fù)合體的非ATP酶亞基p28GANK(Gankyrin)在肝癌中特異性高表達(dá)，并且能夠使抑癌基因Rb發(fā)生磷酸化而失活，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子E2目的活性釋放，促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。這些結(jié)果提示，研究UPS中重要分子的功能，不能僅僅局限于蛋白質(zhì)的降解過程，而更應(yīng)關(guān)注與其他系統(tǒng)

17、或信號(hào)通路的交互作用。
　　 我們與美國(guó)的合作實(shí)驗(yàn)室采用基因表達(dá)譜芯片檢測(cè)70例肝癌患者腫瘤和瘤旁組織樣品，利用生物信息學(xué)分析，結(jié)合Realtime-PCR驗(yàn)證，篩選出在肝癌中異常表達(dá)的基因PSMD4(Proteasome26Snon-ATPaseregulatorysubunit4)，該基因編碼的蛋白是人26S蛋白酶體非ATP酶亞基4，PSMD4分子含有N端的vonWillebrandfactorA模序和C端的兩段15個(gè)氨基酸

18、的泛素相互作用模序(ubiquitininteractingmotif，UIM)。
　　 PSMD4在泛素-蛋臼酶降解系統(tǒng)中的作用一直備受爭(zhēng)議。雖然是最早被鑒定的能夠通過UIM與泛素化蛋白質(zhì)結(jié)合的分子，但是接近90％的泛素化蛋白分子的轉(zhuǎn)運(yùn)和降解并不依賴PSMD4。遺傳學(xué)研究發(fā)現(xiàn)與其他對(duì)于酵母生存至關(guān)重要的大多數(shù)蛋白酶體中其他亞基不同，該基因的缺失并不影響酵母的存活。然而，在擬南芥(Arabidopsisthaliana)，黑腹果

19、蠅(Drosophilamelanogaster)等高等真核生物中，PSMD4的缺失會(huì)導(dǎo)致發(fā)育停滯或者死亡，并且PSMD4基因敲除小鼠在胚胎發(fā)育早期死亡。研究表明，PSMD4除了作為一個(gè)亞基參與蛋白酶體的組裝，有很大一部分處于游離狀態(tài)存在于細(xì)胞漿中，這提示該分子有可能具有類似泛素轉(zhuǎn)運(yùn)體Ubl-UBA(ubiquitin-like，ubiquitin-associated)家族成員Rad23/hHR23，Dsk2/hPLIC/ubiqui

20、lin稗D(zhuǎn)dil等的功能。雖然普遍認(rèn)為泛索轉(zhuǎn)運(yùn)體促進(jìn)蛋白質(zhì)降解，但是諸多的證據(jù)表明，他們也能夠抑制泛素-蛋白酶體系統(tǒng)的活性。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)Rad23能夠劑量依賴地抑制泛素鏈的合成，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中hPLIC可以抑制p53和IkB的降解。有報(bào)道PSMD4與hPLIC-2和hHR23A不僅在遺傳學(xué)和功能上存在聯(lián)系，而且分子之間還有相互作用。最近的研究表明，游離的PSMD4能夠限制泛索結(jié)合蛋白Dsk2與蛋白酶體的結(jié)合，維持泛素-蛋白

21、酶體系統(tǒng)的功能，對(duì)細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的平衡具有重要作用。此外，GeethaA等發(fā)現(xiàn)，PSMD4能夠不依賴泛索地與InhibitorsofDNAbinding(Idl)結(jié)合，促進(jìn)包含basichelix-loop-helix(bHLH)結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子活化并與DNA結(jié)合，調(diào)控細(xì)胞分化。關(guān)于PSMD4與疾病的關(guān)系，已有學(xué)者開展了初步的研究，PSMD4肽鏈的N端能夠被水解為40kd左右的片段，該片段被稱為AntisecretoryFactor1(AF-

22、1)，能夠強(qiáng)烈抑制腸粘膜的分泌功能，并且與免疫調(diào)節(jié)和多種腸道病變相關(guān)。藥物基因組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，染色體Iq21區(qū)域的拷貝數(shù)擴(kuò)增與多發(fā)性骨髓瘤對(duì)bortezomib的耐藥和預(yù)后不良密切相關(guān)，而位于該染色體區(qū)域并在此過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用的基因就是PSMD4。國(guó)外學(xué)者對(duì)肝癌基因表達(dá)譜分析提示PSMD4在肝細(xì)胞癌中呈現(xiàn)高表達(dá)，但并未對(duì)該結(jié)果做進(jìn)一步驗(yàn)證和深入分析。以上這些研究結(jié)果提示，除了參與細(xì)胞蛋白質(zhì)的降解，PSMD4在高等真核生物的發(fā)育和存活等細(xì)

23、胞生物學(xué)過程中也起到了非常重要的作用，在某些疾病的病程中也有一定的作用，但具體的功能和分子機(jī)制尚待闡明。PSMD4在肝癌進(jìn)展中的作用并不清楚，我們希望通過本課題的研究，闡明PSMD4對(duì)肝癌惡性表型的影響及作用機(jī)制。
　　 研究方法：
　　 1.收集臨床肝癌標(biāo)本，利用免疫組化等方法，研究PSMD4在肝癌標(biāo)本中的表達(dá)情況
　　 2.利用慢病毒系統(tǒng)建立干擾PSMD4穩(wěn)定細(xì)胞系，采用CCK8、流式、Western-blo

24、t、Realtime-PCR等方法研究干擾PSMD4對(duì)肝癌惡性表型的影響
　　 3.采用Spheroid形成實(shí)驗(yàn)、流式等方法檢測(cè)PSMD4穩(wěn)定干擾細(xì)胞系肝癌干細(xì)胞表型的變化
　　 4.采用常規(guī)化療藥順鉑刺激穩(wěn)定細(xì)胞系，研究PSMD4對(duì)肝癌細(xì)胞化療敏感性的影響
　　 5.建立大鼠原代肝細(xì)胞分離模型，分離原代肝細(xì)胞并離體培養(yǎng)，用各種生長(zhǎng)因子、炎癥因子刺激原代肝細(xì)胞，研究這些因子對(duì)PSMD4表達(dá)的調(diào)控作用
　　

25、 6.利用Realtime-PCR、Western-blot等方法研究PSMD4對(duì)Ras/Raf/MAPK及PI-3K/Akt信號(hào)通路活性的影響
　　 7.利用Realtime-PCR、Western-blot、免疫共沉淀等方法初步研究PSMD4影響化療敏感性和肝癌干細(xì)胞表型的分子機(jī)制，并探尋PSMD4可能的作用靶點(diǎn)
　　 研究結(jié)果：
　　 1.PSMD4在肝癌臨床樣本中高表達(dá)
　　 2.干擾PSMD4抑

26、制了肝癌細(xì)胞的惡性表型和自我更新能力，并減少了肝癌干細(xì)胞的比例
　　 4.干擾PSMD4提高了肝癌細(xì)胞對(duì)常規(guī)化療藥順鉑的敏感性
　　 5.PSMD4受到生長(zhǎng)因子、炎癥因子的調(diào)控
　　 6.干擾PSMD4抑制Ras/Raf/MAPK及PI-3K/AKT信號(hào)通路的活性
　　 7.PSMD4影響Ras/Raf/MAPK信號(hào)通路關(guān)鍵分子Raf-1的表達(dá)
　　 8.PSMD4影響了β-catenin、Not

27、ch1/3、ABCG2、OCT-4、Sox2等重要干細(xì)胞表
　　 結(jié)論：
　　 本研究通過對(duì)大量臨床肝癌標(biāo)本的研究，發(fā)現(xiàn)PSMD4在肝癌中高表達(dá)。體外研究表明PSMD4能夠促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖和克隆形成的能力、增強(qiáng)肝癌干細(xì)胞表型、影響肝癌細(xì)胞對(duì)化療藥的敏感性。初步的分子機(jī)制研究證實(shí)，PSMD4可能是通過調(diào)控Ras/Raf/MAPK通路、Akt通路的活化，并影響β-catenin等重要分子的表達(dá)從而影響了肝癌細(xì)胞的生物學(xué)特性。