組蛋白去乙?；?在肺腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用.pdf

1、肺癌是腫瘤相關(guān)的首要致死原因，肺腺癌約占原發(fā)性肺癌的30％。許多病人在診斷時病情已到晚期，主要的治療手段對提高生存率已到一個平臺期。鑒于化療效果差，毒性和費(fèi)用高，因此迫切需要深入探討肺腺癌發(fā)生發(fā)展的分子生物學(xué)機(jī)制，以尋找新的治療途徑，改善其預(yù)后。 組蛋白乙?；癄顟B(tài)由組蛋白乙?；?Histone acetyl transferases，HATs)和組蛋白去乙?；?Histone deacetylases，HDACs)調(diào)節(jié)。HA

2、Ts和HDACs之間的動態(tài)平衡控制著染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)和基因的表達(dá)，它們的功能紊亂是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要分子機(jī)制。HATs和HDACs是兩個通過控制組蛋白乙?；?去乙?；癄顟B(tài)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄作用相反的酶。在組蛋白N端賴氨酸的ε-氨基團(tuán)乙酰化中和了賴氨酸的陽性電荷，減少了組蛋白與DNA的結(jié)合，增加了轉(zhuǎn)錄因子與DNA的結(jié)合；而去乙?；瘜?dǎo)致了染色體的緊密性，抑制了基因的表達(dá)。HDACs屬于組蛋白去乙酰化酶超家族，共有Ⅰ-Ⅳ四型。Ⅰ型HDACs包括HDAC1、

3、2、3、8。Ⅱ型HDACs包括HDAC4、5、6、7、9、10。Ⅲ型HDACs包括SIRT2(Sir related proteins)1、2、3、4、5、6、7。Ⅳ型HDACs是HDAC11。 不同的腫瘤類型HDACs的表達(dá)譜不同，腫瘤細(xì)胞中HDAC1高表達(dá)可明顯增加腫瘤細(xì)胞的增殖能力，并且HDAC1高表達(dá)可影響細(xì)胞外基質(zhì)而使腫瘤細(xì)胞移行和侵襲力明顯加強(qiáng)。研究發(fā)現(xiàn)胃癌和前列腺癌細(xì)胞中HDAC1高表達(dá)。在胃癌、結(jié)直腸癌、宮頸的非

4、典型增生以及子宮內(nèi)膜間質(zhì)肉瘤HDAC2過表達(dá)。Glaser KB等在HeLa細(xì)胞株中用siRNA干擾Ⅰ型和Ⅱ型HDACs(HDAC1，2，3，4，7)后發(fā)現(xiàn)，HDAC1和HDAC3是腫瘤細(xì)胞存活和增殖所必需的，用siRNA干擾HDAC1和HDAC3可引起組蛋白超乙?；?，抑制HeLa細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡。siRNA單獨干擾人骨肉瘤U2OS細(xì)胞、乳腺癌MCF7細(xì)胞HDAC1可引起細(xì)胞阻滯在G1或G2/M期細(xì)胞靜止而不能進(jìn)行有絲分裂從而導(dǎo)致細(xì)胞

5、生長抑制，并增加細(xì)胞凋亡，而單獨干擾HDAC2則無此效果。這些研究表明HDAC1在腫瘤細(xì)胞增殖中起至關(guān)重要的作用。HDAC1在肺癌中的表達(dá)，以及對肺癌細(xì)胞株的發(fā)生和發(fā)展是否起重要作用，尚無相關(guān)報道。 HDACi(HDACs inhibitor，HDACi)已被廣泛應(yīng)用于體內(nèi)外研究腫瘤發(fā)展等相關(guān)基因去抑制的效果。HDACi對基因表達(dá)的調(diào)控不是通過直接修飾DNA序列，而是通過協(xié)助DNA緊密地結(jié)合在組蛋白氨基端上阻止腫瘤抑制基因的轉(zhuǎn)

6、錄和表達(dá)來發(fā)揮作用的。許多HDACi如曲古菌素A(trichostatin A，TSA)、丁酸酯等通過誘導(dǎo)細(xì)胞生長抑制、分化和凋亡而起到抗腫瘤作用。HDACi還可激活死亡受體通路和誘導(dǎo)凋亡。這些研究已證明HDACi的抗增殖和抗腫瘤作用。小分子HDACi對不同的HDACs幾乎沒有選擇性。HDACi的效果更多依賴于腫瘤細(xì)胞的類別而不是所選抑制劑的類型。TSA對多個非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株增殖均有抑制作用，而且對HDACⅠ類和Ⅱ類均有抑制作用，在非

7、小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株中尚無明確抑制HDACs靶位的報道。TSA作為一種高特異性、穩(wěn)定而有效的組蛋白去乙酰化酶抑制劑而備受關(guān)注，是目前國際上公認(rèn)的研究?；瘜?xì)胞影響的可靠模式。 本課題通過檢測肺腺癌和癌旁組織中的HDAC1 mRNA和蛋白表達(dá)差異，初步探討HDAC1基因和肺腺癌的關(guān)系。在體外用RNA干擾技術(shù)沉默肺癌細(xì)胞株HDAC1，觀察細(xì)胞增殖、凋亡和周期的變化，同時與TSA干預(yù)比較，探討HDAC1在肺腺癌增殖中的作用，明確HDAC

8、i抑制腫瘤細(xì)胞增殖的主要靶點，對藥物的篩選和新的藥物合成，有著極為重要的意義。進(jìn)一步觀察細(xì)胞Bax，Bcl-2，cyclin B1和p21表達(dá)初步探討HDAC1與細(xì)胞增殖、凋亡和周期的關(guān)系。 一、人肺腺癌組織中HDAC1 mRNA和蛋白的表達(dá) 目的：檢測組蛋白去乙酰化酶家族成員HDAC1在肺腺癌組織和癌旁組織中的表達(dá)情況，初步探討HDAC1與肺腺癌的關(guān)系。 材料和方法：收集手術(shù)切除的肺腺癌組織及相應(yīng)的癌旁組織共6

9、例，HE染色明確病理類型。采用Real-time PCR和Western blotting技術(shù)檢測6例肺腺癌組織和癌旁組織中HDAC1 mRNA和蛋白的表達(dá)情況。免疫組化明確HDAC1的表達(dá)位置。 結(jié)果：Real-time PCR和Western blotting結(jié)果表明發(fā)現(xiàn)肺腺癌患者HDAC1在癌組織中表達(dá)顯著高于癌旁組織高。免疫組化發(fā)現(xiàn)HDAC1在細(xì)胞核中高表達(dá)。 結(jié)論：肺腺癌HDAC1基因較癌旁組織表達(dá)高，其與腺癌

10、的發(fā)生可能相關(guān)。 二、HDAC1 siRNA和TSA對肺腺癌細(xì)胞體外增殖及凋亡的影響 目的：探討HDAC1 siRNA對肺腺癌細(xì)胞株增殖、細(xì)胞周期及凋亡的影響，與HDACs多靶點的抑制劑TSA的作用進(jìn)行比較，明確HDAC1在肺腺癌增殖中的作用。 材料和方法：采用HDAC1 siRNA瞬間轉(zhuǎn)染腺癌細(xì)胞株A549和NCI-H1299。采用Real-time PCR和Western blotting檢測HDAC1 si

11、RNA瞬間轉(zhuǎn)染的效率；采用MTT法測定細(xì)胞瞬間轉(zhuǎn)染HDAC1 siRNA后的增殖情況；應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測HDAC1siRNA瞬間轉(zhuǎn)染細(xì)胞后細(xì)胞周期及凋亡的影響，并與TSA干預(yù)作用相對比。 結(jié)果：肺腺癌細(xì)胞株A549和NCI-H1299在HDAC1 siRNA轉(zhuǎn)染后，HDAC1在mRNA水平和蛋白水平均出現(xiàn)明顯的下降。HDAC1 siRNA轉(zhuǎn)染腺癌細(xì)胞株增加了AC-H4的表達(dá)。在A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染HDAC1 siRNA48h后，與T

12、SA(0.2μM)作用48h導(dǎo)致存活率下降相近(69％＆63％)。在NCI-H1299細(xì)胞中HDAC1 siRNA轉(zhuǎn)染48h后，與TSA(0.4μM)作用48h導(dǎo)致存活率下降相近(83％＆76％)。HDAC1 siRNA沉默基因后和一定濃度下對多個靶點HDACs有乙?；种谱饔玫腡SA干預(yù)，得到相似的抑制腫瘤增殖效應(yīng)。在A549細(xì)胞HDAC1 siRNA轉(zhuǎn)染后發(fā)現(xiàn)，早期凋亡增加與轉(zhuǎn)染前相比(13.45％vs5.22％)，和TSA干預(yù)相似

13、。在NCI-H1299細(xì)胞株中予以一定濃度的TSA未出現(xiàn)早期凋亡增加，HDAC1 siRNA轉(zhuǎn)染后發(fā)現(xiàn)凋亡增加(11.76％vs8.09％)。HDAC1 siRNA轉(zhuǎn)染后腺癌細(xì)胞株均出現(xiàn)G2期阻滯。 結(jié)論：HDAC1 siRNA轉(zhuǎn)染對肺腺癌細(xì)胞株增殖有抑制作用，誘導(dǎo)肺腺癌細(xì)胞株阻滯在G2期，促細(xì)胞凋亡。 三、HDAC1 siRNA和TSA對肺腺癌細(xì)胞的作用機(jī)制研究 目的：探討HDAC1沉默引起對肺腺癌細(xì)胞株增殖、

14、凋亡變化的機(jī)制。 方法：采用脂質(zhì)體法HDAC1 siRNA瞬時轉(zhuǎn)染和TSA干預(yù)人肺腺癌A549和H1299細(xì)胞株。采用Real-timePCR檢測HDAC1 siRNA轉(zhuǎn)染對Bcl-2、Bax、p21和細(xì)胞周期cyclinB1 mRNA水平的影響，并與TSA干預(yù)比較。采用Western blotting檢測HDAC1 siRNA轉(zhuǎn)染前后Bcl-2、Bax、p21和細(xì)胞周期蛋白cyclinB1的蛋白水平變化。 結(jié)果：Rea

15、l-time PCR檢測HDAC1 siRNA轉(zhuǎn)染后和TSA干預(yù)后A549細(xì)胞內(nèi)Bcl-2和CyclinBl mRNA與對照組相比分別降低37％和57％。與對照組相比Bax和p21mRNA水平分別增高4.82和3.38倍。HDAC1 siRNA轉(zhuǎn)染NCI-H1299細(xì)胞株CyclinB1mRNA與對照組相比減低49％，Bcl-2 mRNA無明顯差異，Bax和p21 mRNA與對照組相比分別增高3.88和3.91倍。Western-blo

16、tting測定蛋白表達(dá)水平與mRNA結(jié)果一致。在A549細(xì)胞中HDAC1 siRNA轉(zhuǎn)染后，p53表達(dá)增高。 結(jié)論：HDAC1沉默能抑制原癌基因Bcl-2，增加抑癌基因Bax、p21的表達(dá)，而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；并能通過減低Cyclin B1的表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞停滯在G2期。 通過上述研究，本課題得出以下結(jié)論： 1、肺腺癌組織中HDAC1基因及蛋白的表達(dá)水平均顯著高于癌旁組織，其與腺癌的發(fā)生可能相關(guān)。 2、HDAC

17、1 siRNA轉(zhuǎn)染肺腺癌細(xì)胞株的增殖有抑制作用，并能誘導(dǎo)肺腺癌細(xì)胞阻滯在G2期，促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞凋亡。 3、HDAC1 siRNA轉(zhuǎn)染能抑制肺腺癌細(xì)胞內(nèi)原癌基因Bcl-2和細(xì)胞周期調(diào)控蛋白cyclinB1表達(dá)，增加抑癌基因Bax、p21的表達(dá)，從而使腫瘤細(xì)胞停滯于G2期，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。 全文總結(jié)：HDAC1在肺腺癌的發(fā)生、發(fā)展中具有一定的促進(jìn)作用。通過干擾HDAC1的表達(dá)可對肺腺癌細(xì)胞的增殖、凋亡和細(xì)胞周期產(chǎn)生顯著的影響。