組蛋白去乙?；?在高同型半胱氨酸血癥致腎臟損傷中的作用.pdf

1、研究目的:
　　高同型半胱氨酸血癥(hyperhomocysteinemia, hHcys)是終末期腎病進(jìn)展過(guò)程中的一個(gè)關(guān)鍵獨(dú)立致病因子，這一點(diǎn)已非常明確，但hHcys致腎臟損傷的病理生理學(xué)機(jī)制仍須深一步研究。
　　近年來(lái)，表觀(guān)遺傳學(xué)在腎臟疾病中的研究受到越來(lái)越多的關(guān)注，組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶(HAT)和組蛋白去乙酰化酶(HDAC)對(duì)于組蛋白賴(lài)氨酸殘基的乙?；降恼{(diào)控是其重要內(nèi)容之一。HDAC共分為四類(lèi)18個(gè)亞型:Ⅰ類(lèi)(Cla

2、ssⅠ)為Rpd3樣蛋白，包括HDAC1，HDAC2，HDAC3，HDAC8;Ⅱ類(lèi)(ClassⅡ)為Hda1樣蛋白，又分Ⅱa類(lèi)即HDAC4，HDAC5，HDAC7，HDAC9和Ⅱib類(lèi)即HDAC6，HDAC10;Ⅲ類(lèi)(ClassⅢ)為Ser2樣蛋白，包括SIRT1-7;Ⅳ類(lèi)(ClassⅣ)為HDAC11。ClassⅠ、Ⅱ和Ⅳ為Zn2+依賴(lài)型，ClassⅢ為NAD+依賴(lài)型。越來(lái)越多的證據(jù)也表明HDAC可調(diào)控非組蛋白的去乙?；?。雖然，廣譜類(lèi)

3、HDAC抑制劑在腫瘤治療領(lǐng)域已經(jīng)展現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景，但其缺點(diǎn)也非常明顯，如缺乏對(duì)HDAC亞型的特異性作用，進(jìn)而引起的副作用也比較嚴(yán)重。并且，有研究發(fā)現(xiàn)HDAC參與到了腎臟纖維化進(jìn)程中，雖然其所介導(dǎo)的腎臟纖維化機(jī)制并不十分清楚，可能與調(diào)節(jié)炎性因子、促纖維化因子的表達(dá)和激活介導(dǎo)腎臟纖維化信號(hào)通路有關(guān)。因此，在hHcys致腎臟損傷中，何種亞型HDAC起到作用及其機(jī)制有待明確和探討。
　　研究表明，Hippo信號(hào)通路與腎臟損傷有著密切的

4、聯(lián)系，參與腎臟纖維化等過(guò)程。為此，本課題將研究HDAC在hHcys誘導(dǎo)的腎臟損傷中的作用，并進(jìn)一步闡明Hippo信號(hào)通路是否參與相關(guān)調(diào)控。
　　實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果:
　　1.HDAC在hHCys模型動(dòng)物腎臟中的表達(dá)
　　對(duì)C57BL/6J野生雄性小鼠（10周齡）摘除單腎，一周后隨機(jī)分為兩組，采用不含葉酸的飼料喂養(yǎng)8周來(lái)構(gòu)建hHcys動(dòng)物模型，喂養(yǎng)正常飼料組作為對(duì)照。高效液相色譜法檢測(cè)不含葉酸飲食血漿總同型半胱氨酸含量升高，

5、證明hHcys模型構(gòu)建成功。送檢尿液樣品中尿白蛋白/肌酐比值升高。過(guò)碘酸-雪夫染色方法對(duì)小鼠腎臟石蠟切片進(jìn)行染色和透射電鏡的方法觀(guān)察足細(xì)胞損傷，結(jié)果顯示hHcys小鼠腎臟中出現(xiàn)明顯的系膜基質(zhì)增生，基底膜增厚，足突融合，表明腎小球存在損傷;Masson染色方法對(duì)小鼠腎臟石蠟切片進(jìn)行染色，hHcys模型腎臟中出現(xiàn)纖維化病變，提示腎臟功能障礙，腎小管出現(xiàn)損傷。通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR發(fā)現(xiàn)，11個(gè)HDAC亞型中HDAC9表達(dá)升高最為明顯。通過(guò)蛋白

6、免疫印跡免疫組織化學(xué)染色、免疫熒光雙重標(biāo)記檢測(cè)HDAC9在腎臟中表達(dá)變化和分布，相比其他部分Zn2+依賴(lài)型HDAC，HDAC9在hHcys模型小鼠腎臟皮質(zhì)中表達(dá)上調(diào)最為明顯，在足細(xì)胞、遠(yuǎn)曲小管和集合管中均表達(dá)升高。通過(guò)L型同型半胱氨酸刺激足細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞，結(jié)果顯示HDCA9呈現(xiàn)劑量依賴(lài)性升高。
　　2.HDAC9在hHcys致腎臟損傷中的作用及機(jī)制
　　HDAC9基因沉默大鼠模型構(gòu)建采用大鼠腎臟局部注射重組的包備有sh

7、RNA-HDAC9的慢病毒載體pGLV3/H1/GFPtPuro(pGLV3)介導(dǎo)大鼠腎臟HDAC9基因沉默，二十只SD雄性大鼠隨機(jī)平均分為四組，構(gòu)建hHcys動(dòng)物模型。IF實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，慢病毒攜帶的綠色熒光蛋白(GFP)廣泛表達(dá)，并且與足細(xì)胞標(biāo)志物synaptopodin和集合管標(biāo)志物AQP3共定位。進(jìn)行Masson染色分析，結(jié)果顯示，HDCA9沉默減輕高同型半胱氨酸血癥誘導(dǎo)的腎臟纖維化。PAS染色結(jié)果說(shuō)明，腎小球基底膜的增厚和系膜增

8、生能一定程度上被HDAC9沉默所緩解。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)IF、IHC和體外實(shí)驗(yàn)WB結(jié)果顯示由hHcys所介導(dǎo)的足細(xì)胞裂孔隔膜相關(guān)蛋白nephrin表達(dá)下調(diào)和正常結(jié)構(gòu)形態(tài)的破壞能夠一定程度上被HDAC9的沉默所逆轉(zhuǎn)，并且纖維連接蛋白fibronectin這一促纖維化因子在hHcys介導(dǎo)下的高表達(dá)能夠一定程度上被HDAC9的沉默所抑制。
　　hHcys模型大鼠腎臟中，Hippo核心蛋白YAP表達(dá)上調(diào)，可被HDAC9沉默所抑制。體外實(shí)驗(yàn)中，L-H

9、cys能夠誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞中YAP的表達(dá)上調(diào)，基因沉默HDA9可以阻斷YAP對(duì)Hcys的應(yīng)答，并且下游Smad2、Smad3的活性也被抑制，表明HDAC9可能通過(guò)YAP-Smad2/3信號(hào)通路來(lái)促進(jìn)hHcys誘導(dǎo)的腎臟損傷。
　　結(jié)論與創(chuàng)新性:
　　1.本研究次發(fā)現(xiàn)HDAC9在hHcys模型小鼠和大鼠腎臟中顯著升高，并且在HK-2和HPC細(xì)胞中，HDAC9呈現(xiàn)出Hcys劑量依賴(lài)性升高。基因沉默HDAC9減輕了hHcys介導(dǎo)的