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文檔簡(jiǎn)介
1、目的:高同型半胱氨酸血癥(Hyper-homocysteinemia HHCY)是腦卒中、血管性癡呆、阿爾茨海默病、帕金森等多種老年退行性疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。但 HHCY對(duì)腦組織中不同細(xì)胞的損傷作用及機(jī)制目前還不清楚。本課題擬利用ApoE-/-小鼠復(fù)制 HHCY動(dòng)物模型,從形態(tài)學(xué)觀察腦中微血管、星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元的分布與超微結(jié)構(gòu)變化;從分子水平檢測(cè)相關(guān)損傷因子的表達(dá)變化,探討 HHCY對(duì)腦血管及神經(jīng)元的損傷作用,為明確 HHCY相關(guān)的
2、神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的發(fā)病機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)將分兩部分來(lái)完成:實(shí)驗(yàn)一HHCY致ApoE-/-小鼠腦血管損傷作用的研究;實(shí)驗(yàn)二 HHCY抑制ApoE-/-小鼠大腦星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP表達(dá)致神經(jīng)元損傷作用的研究。
方法:C57BL/6J背景5周齡雄性純合子ApoE-/-小鼠36只,體重為18-20g,與同周齡C57BL/6J小鼠12只,體重體重為18-20g,適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。按照隨機(jī)化原則分為4組每組12只:正常對(duì)照組(bla
3、nk control)野生型C57BL/6J小鼠飼以普通AIN-93G飼料; ApoE-/-對(duì)照組(ApoE-/-control):飼以普通 AIN-93G飼料;高蛋氨酸組(HM):飼以添加1.7%蛋氨酸的普通AIN-93G飼料;葉酸、維生素B12干預(yù)組(HM+FA+VB):添加1.7%蛋氨酸、0.006%葉酸、0.0004%維生素B12的普通AIN-93G飼料。喂養(yǎng)18周后麻醉取血,全自動(dòng)生化儀檢測(cè)血漿HCY水平;石蠟包埋腦組織切片行
4、HE染色和GFAP、CD31、iba1的免疫組化染色,并計(jì)數(shù)皮質(zhì)區(qū)血管數(shù)量;行電鏡檢查觀察大腦皮質(zhì)腦微血管、星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元的超微構(gòu)變化;提取腦血管蛋白,western blot檢測(cè)腦血管SIRT1的蛋白表達(dá);提取全腦蛋白,western blot檢測(cè)GFAP的蛋白表達(dá)。
結(jié)果:⑴18周蛋氨酸飲食可以誘導(dǎo) ApoE-/-小鼠 HHCY。⑵各組小鼠的血壓(實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前、實(shí)驗(yàn)中期、處死小鼠前)和心率及大腦皮質(zhì)區(qū)微血管數(shù)量均無(wú)明顯
5、差異(P>0.05)。⑶HHCY可以導(dǎo)致ApoE-/-小鼠腦血管超微結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化,包括內(nèi)膜、基底膜受損,細(xì)胞器的空泡變性,葉酸+VB12對(duì)其有一定干預(yù)作用。⑷western blot結(jié)果均顯示HHCY能明顯減少腦血管SIRT1蛋白表達(dá),與空白對(duì)照組與ApoE-/-對(duì)照組相比較,高蛋氨酸組腦血管 SIRT1蛋白表達(dá)減少(P<0.05),葉酸+VB12干預(yù)后其表達(dá)增加(P<0.05)。⑸HE染色發(fā)現(xiàn)各組腦組織結(jié)構(gòu)基本正常,神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)
6、胞的分布各組間無(wú)明顯差異,僅在高蛋氨酸組發(fā)現(xiàn)個(gè)別固縮的神經(jīng)元,星形膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)也無(wú)明顯改變。⑹HHCY可以導(dǎo)致 ApoE-/-小鼠神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)損傷,表現(xiàn)為:神經(jīng)元核膜皺縮,染色質(zhì)濃集,線粒體腫脹,部分空泡變性,胞漿內(nèi)見(jiàn)較多脂褐素沉積;星形膠質(zhì)細(xì)胞核膜稍皺縮,并可見(jiàn)線粒體空泡變性。葉酸+VB12對(duì)其有一定干預(yù)作用。⑺免疫組化和western blot結(jié)果均顯示HHCY能明顯減少大腦皮質(zhì)區(qū)和海馬區(qū)GFAP表達(dá)減少(P<0.
7、05),葉酸+VB12干預(yù)后其表達(dá)增加(P<0.05)。⑻免疫組化結(jié)果顯示高蛋氨酸組大腦皮質(zhì)iba1表達(dá)較空白對(duì)照組與ApoE-/-對(duì)照組增加(P<0.05),葉酸+VB12干預(yù)后其表達(dá)減少(P<0.05)。
結(jié)論:HHCY致ApoE-/-小鼠腦血管內(nèi)皮損傷,伴腦血管SIRT1表達(dá)下調(diào); HHCY抑制ApoE-/-小鼠大腦星形膠質(zhì)細(xì)胞活化,GFAP表達(dá)下調(diào),并伴隨神經(jīng)元的老化損傷和小膠質(zhì)細(xì)胞的活化;葉酸+VB12可能存在一定干
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