高同型半胱氨酸血癥抑制血管再生的機制研究.pdf

1、高同型半胱氨酸血癥(HHcy)是心血管疾病的獨立危險因素之一。大量的臨床研究以及流行病學調查表明高同型半胱氨酸血癥與心血管疾病發(fā)病率密切相關。Meta分析也發(fā)現血清同型半胱氨酸(Hcy)每增加5μmol/L，罹忠心血管疾病風險增加1.6-1.8倍。
　　HHcy可以抑制內皮細胞生長和內皮損傷后的再內皮化，損害內皮的舒張功能，并能加速血管內膜的增生，同時促進平滑肌細胞增生。我們知道，在各種病理狀態(tài)下，血管再生的過程都參與其中。血管再

2、生是一種不同于血管發(fā)育的，在病理條件下受嚴格調控的血管生成，但Hcy如何影響血管再生的機制并不清楚。本課題我們研究高同型半胱氨酸血癥對血管再生的影響及機制。
　　第一部分:高同型半胱氨酸抑制血管再生
　　目的:
　　運用多種經典血管再生模型觀察高同型半胱氨酸血癥對血管再生的影響。
　　方法:
　　1、選用轉基因Tg-hCBS+Cbs+/-\-/-小鼠（Kruger實驗室，費城，賓夕法尼亞），由于其胱硫醚β合

3、成酶(CBS，cystathionine-β-synthase)缺乏，致使同型半胱氨酸代謝中轉硫基途徑受阻，血清同型半胱氨酸水平自發(fā)上升，一般可達到重度高同型半胱氨酸血癥(血清同型半胱氨酸＞115μmol/L)。乳鼠出生10日之內進行基因測定。
　　2、運用多種經典血管再生模型，觀察小鼠血管再生。2.1眼球視網膜血管染色:選取出生后1天，3天，7天，14天乳鼠及8-12周成年雄性小鼠，處死后摘取眼球，分離視網膜，免疫熒光染色視網膜

4、血管內皮細胞（Isolectin B4染色），激光共聚焦顯微鏡下逐層掃描，重組3D圖像，每個樣本選取3個層面計數視網膜血管網長度總和，比較對照組與高同型半胱氨酸血癥小鼠視網膜血管密度及長度。2.2主動脈環(huán)微血管生成(Aortic ring assay)。分離小鼠主動脈(長約10mm)，清理干凈周圍脂肪組織及血液，切成多個約1mm長度血管環(huán)，種植于基質膠(Matrigel)上，每日拍照并計數微血管生長。
　　結果:
　　1、高

5、同型半胱氨酸血癥抑制乳鼠的視網膜血管的生長，同時成年小鼠的視網膜血管網血管再生也受到抑制(p＜0.05)。
　　2、高同型半胱氨酸抑制小鼠主動脈環(huán)微血管生成。在主動脈環(huán)接種于基質膠的第5天，可以觀察到高同型半胱氨酸血癥組（hCBS+Cbs-/-小鼠）的主動脈環(huán)微血管生成受抑制。主動脈環(huán)微血管生成同時呈現了同型半胱氨酸濃度依賴性，隨著濃度升高，微血管生長抑制加強。
　　結論:
　　高同型半胱氨酸血癥小鼠血管再生受抑制。<

6、br>　　第二部分:高同型半胱氨酸血癥致使肝細胞生長因子(HGF)釋放減少從而抑制血管再生
　　目的:
　　探討高同型半胱氨酸抑制血管再生的分子機制
　　方法:
　　1、小管形成(Tube formation)。選取人主動脈內皮細胞（HAEC）以及人微小血管內皮細胞(HMVEC-C)，傳代至第8代后，分別使用不同濃度DL-Hcy（100/200/500μm）處理細胞24小時?；|膠(Matrigel)預先鋪板（9

7、6孔板），胰酶消化細胞后，種植于基質膠(Matrigel)上，8小時后觀察小管形成情況，計數小管形成個數及長度;
　　2、血管再生基因RT2ProfilerTMPCR篩查。此PCR基因篩查試劑盒包含血管再生過程中的84個主要基因，其中包括生長因子及其受體，趨化因子和細胞因子，粘附因子，蛋白酶以及抑制劑和轉錄因子等。提取來自對照組以及Hcy處理組的人主動脈內皮細胞（HAEC）總RNA，Real-time PCR檢測基因表達，確定有意

8、義的上調或下調基因。
　　3、Real-Time PCR。以篩選出的肝細胞生長因子（Hepatocyte growth factor，HGF)為目標基因，提取HAEC/小鼠主動脈/小鼠心臟組織總RNA，樣本分別來自細胞對照組和Hcy處理組以及8-12周齡對照組小鼠（hCBS+Cbs+/-小鼠）和高同型半胱氨酸血癥組小鼠（hCBS+Cbs-/-小鼠），設計HGF基因引物，檢驗HGF基因表達水平在兩組間的差異。
　　4、West

9、ern blot，提取HAEC/小鼠主動脈/小鼠心臟組織總蛋白，樣本分別來自細胞對照組和Hcy處理組以及8-12周齡對照組小鼠（hCBS+Cbs+/-小鼠）和高同型半胱氨酸血癥組小鼠（hCBS+Cbs-/-小鼠），Western blot檢驗HGF蛋白表達水平在兩組間的差異。
　　5、建立小鼠急性心肌梗死模型。結扎小鼠左冠狀動脈，建立急性心肌梗死模型。手術2周后，處死小鼠，收集心臟組織，提取心臟總蛋白，測定組織中HGF蛋白表達水平

10、。
　　6、酶聯免疫吸附試驗(ELISA)測定小鼠血清HGF水平。外周血血清樣本收集自8-12周齡hCBS+Cbs+/-小鼠和hCBS+Cbs-/-小鼠，使用HGF ELISA試劑盒，酶標儀450nm波長下測定吸光度，計算樣品濃度，同時收集心肌梗死2周后小鼠血清樣本，測定HGF水平。
　　7、加入HGF改善Hcy抑制的小管形成，主動脈環(huán)微血管生成。運用小管形成及主動脈環(huán)微血管模型，加入不同濃度外源性人工合成HGF（50/10

11、0/150ng/ml），觀察其能否逆轉Hcy抑制的小管形成以及主動脈環(huán)微血管形成（實驗與觀察方法同前）。
　　結果:
　　1、Hcy抑制小管形成。經DL-Hcy(100/200/500μm)處理(24h)后的HAEC以及HMVEC-C，小管長度以及小管數量明顯減少，并呈濃度依賴性，具有統計學意義。
　　2、血管再生基因RT2ProfilerTMPCR篩查（設定以4倍變化為有統計學意義）。比較對照組與Hcy處理組，在84

12、個主要基因中，Collagen，typeⅣ, alpha3(COL4A3); Epiregulin(EREG); Hepatocyte growthfactor(HGF),Interferon(IFNB1&IFNG), and Leukocyte cell derived chemotaxin1(LECT1)均顯著下調。其中Hepatocyte growth factor(HGF)下調最為顯著，為20倍下調。
　　3、Hcy下調H

13、AEC/小鼠主動脈/小鼠心臟組織肝細胞生長因子HGF mRNA及蛋白表達水平。
　　4、HGF在高同型半胱氨酸血癥小鼠心肌梗死組織中的蛋白表達水平下降。提取心肌梗死后2周的心臟組織，同型半胱氨酸血癥組相較于對照組HGF蛋白表達水平明顯下降，*P＜0.05 vs hCBS+Cbs+/-+MI(n=6).
　　5、血清HGF水平在高同型半胱氨酸血癥小鼠中降低。ELISA結果表明，高同型半胱氨酸血癥小鼠的外周血血清HGF水平顯著低

14、于對照組(*P＜0.05 vshCBS+Cbs+/-(n=8))，并且心肌梗死后2周高同型半胱氨酸血癥小鼠的外周血血清HGF水平也顯著低于對照組。
　　6、人工合成外源性HGF能顯著改善Hcy抑制的小管形成以及主動脈環(huán)微血管生成。其結果具有統計學意義。外源性人工合成HGF的濃度達到100ng/ml時，開始逆轉Hcy的抑制作用，當濃度達到150ng/ml時修復作用加強。
　　結論:
　　Hcy通過抑制肝細胞生長因子(HG

15、F)的生成與分泌從而抑制血管再生
　　第三部分:高同型半胱氨酸抑制小鼠心肌梗死后血管再生的內皮祖細胞機制
　　目的:
　　探討內皮祖細胞參與的高同型半胱氨酸血癥小鼠心肌梗死后的血管再生
　　方法:
　　1、測定高同型半胱氨酸血癥小鼠心肌梗死后血管再生情況。1.1小動物超聲心動圖常規(guī)評價8-12周齡hCBS+Cbs+/-小鼠與hCBS+Cbs-/-小鼠心功能，并取小鼠心臟切片，分別染色后計數心臟毛細血管密度;

16、1.2建立小鼠心肌梗死模型(Under the help of Dr.Gao)。結扎小鼠左冠狀動脈，建立急性心肌梗死模型（Myocardial infarction，MI），觀察心肌梗死小鼠6周后生存率，超聲心動圖觀測兩個實驗組hCBS+Cbs+/-+MI組與hCBS+Cbs-/-+MI組的心臟左室舒張末徑(LVEDD)，左室收縮末徑(LVESD)，左室壁和室間隔厚度，計算左室射血分數(LVEF);1.3心肌梗死第2周及第6周末，處死小

17、鼠后，取心臟，冰凍切片，行HE染色，TTC染色，觀察形態(tài)學差別;CD31（內皮細胞）染色，計數心臟毛細血管密度;TUNEL染色，計數心肌梗死后細胞凋亡情況。
　　2、流式細胞儀檢測內皮祖細胞(Endothelial progenitor cell，EPC):流式細胞儀檢測干細胞抗原-1(Sca-1+)以及血管生長因子受體-2(VEGFR-2+)均為陽性的細胞為內皮祖細胞(EPC)，同時檢測小鼠外周血源性(PB)EPC以及骨髓源性(

18、BM)EPC比例;2.1比較8-12周齡hCBS+Cbs+/-小鼠與hCBS+Cbs-/-小鼠之間外周血(PB)源性/骨髓(BM)源性內皮祖細胞比例以及內皮祖細胞死亡率(violet deadcell染色);2.2比較在hCBS+Cbs+/-+MI與hCBS+Cbs-/-+MI組之間，小鼠心肌梗死后2周及6周PB/BM的EPC比例以及細胞死亡率。
　　3、骨髓源性Sca-1+細胞靜脈注射治療，對于小鼠心肌梗死后血管再生修復的作用。

19、3.1骨髓源性Sca-1+細胞的分離。選用綠色熒光蛋白轉基因工具小鼠（C57BL/6-gfp小鼠），鼠齡在6-10周不等，取得四肢長骨中的骨髓細胞后，Histopaque-1083密度梯度離心法分層提取出骨髓中的單個核細胞(Mononuclearcells，MNC)，Sca-1抗體染色MNC，將細胞用超級順磁性的MACS MicroBeads（MACS微型磁珠）特異性地標記，置于一個強而穩(wěn)定磁場中，分選出Sca-1+細胞，上流式細胞儀檢

20、驗細胞分離純度;3.2建立心肌梗死模型，結扎小鼠左冠狀動脈，關胸后，不待小鼠清醒，立即球后注射200μl預先提取的骨髓源性Sca-1+細胞(2×106/200μl)，注射后的24小時/48小時/72小時分別尾靜脈取血涂片，并球后取血200μl，流式細胞儀檢測外源性Sca-1+細胞在體循環(huán)情況;3.3小動物在體拍照系統，Sca-1+細胞球后注射后示蹤，分別于0h/22h/72h拍照，進一步觀察細胞的去向。
　　4、Sca-1+細胞的

21、治療對于心肌梗死后血管再生的作用。4.1觀察心肌梗死小鼠經細胞治療后的生存率，超聲心動圖觀測各個實驗組心臟左室舒張末徑(LVEDD)，左室收縮末徑(LVESD)，左室壁和室間隔厚度，計算左室射血分數(LVEF);4.2流式細胞儀檢測建立模型后2周/4周/6周的PB/BM EPC比例;4.3第2周及第6周末取各實驗組小鼠心臟，冰凍切片，IB4（內皮細胞）染色后計數毛細血管密度。
　　結果:
　　1、高同型半胱氨酸血癥抑制小鼠心

22、肌梗死后的血管再生。8-12周齡的高同型半胱氨酸（hCBS+Cbs-/-）小鼠射血分數低于對照組（hCBS+Cbs+/-）小鼠，具有統計學意義，并且其心臟毛細血管密度低于對照組小鼠。建立小鼠心肌梗死模型后，hCBS+Cbs-/-小鼠的生存率明顯低于對照組，幾乎很難存活，且存活的高同型半胱氨酸血癥小鼠（hCBS+Cbs-/-+MI組）射血分數、心臟毛細血管密度均低于對照組，細胞凋亡率高于對照組。
　　2、8-12周齡高同型半胱氨酸血

23、癥小鼠(hCBS+Cbs-/-)外周血(PB)源性內皮祖細胞比例低于對照組;骨髓(BM)源性內皮祖細胞比例高于對照組，但細胞死亡率高于對照組。同時比較hCBS+Cbs+/-+MI與hCBS+Cbs-/-+MI組，兩組小鼠心肌梗死后2周及6周PB以及BM來源的EPC比例，高同型半胱氨酸組均低于對照組，且細胞死亡率均高于對照組。
　　3、骨髓源性Sca-1+細胞治療，對于小鼠心肌梗死后血管再生修復的作用。骨髓源性Sca-1+細胞純化率

24、可達85％左右，球后注射細胞24h后，GFP+細胞占外周血的1.75％，72h后，下降至0.65％;在體動物拍照示蹤可見細胞球后注射6h后大多聚集于肝臟和胸腔，22h后大部分聚集在心腔。經過骨髓源性Sca-1+細胞靜脈注射治療，高同型半胱氨酸血癥組（hCBS+Cbs-/-）小鼠以及對照組(hCBS+Cbs+/-)小鼠心肌梗死后生存率均得到提高，hCBS+Cbs-/-小鼠組6周生存率從12.5％上升到27.3％，hCBS+Cbs+/-小鼠

25、組從62.5％上升到80％，均具有統計學意義。hCBS+Cbs-/-小鼠組6周末左室射血分數(LVEF)由19.3％上升到38.5％，對照組由31.6％上升至50.9％，具有統計學意義;流式細胞儀檢測MI+細胞治療后2周/4周/6周的PB/BM EPC比例顯示:對照組（hCBS+Cbs+/-）小鼠中，接受細胞治療后外周血EPC比例顯著增高，由單純心肌梗死模型（2周末）的0.46％，上升到0.76％，hCBS+Cbs-/-小鼠組也從0.3